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人参皂苷Rg1通过调节GSK-3β/PP2A活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化
目的 探讨人参皂苷Rg1是否通过调节GSK-3β/PP2A活性而减轻凝聚态Aβ25～35诱导的胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.方法 选用孕期(18±2)d的SD大鼠,分离纯化胎鼠皮层神经元.实验分为阴性对照组、模型组、LiCl处理组、Rg1预处理组.阴性对照组不加任何处理因素;模型组用20μmol/L Aβ25～35作用于皮层神经元12h;LiCl处理组用10mmol/L LiCl和20μmol/L Aβ25～35共同作用于皮层神经元12h;Rg1预处理组分别用5、10、20、40、80μmol/L Rg1预处理皮层神经元24h,再加入20μmol/L Aβ25～35作用12h.通过免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测皮层神经元Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)表达水平,通过非放射性免疫法检测皮层神经元蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性.结果 模型组Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均增加,但PP2A的活性不受影响;LiCl处理组和Rg1预处理组,Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均降低(P＜0.05).在Rg1预处理组中,以20μmol/L Rg1预处理后Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的表达水平下降为明显,而且PP2A的活性明显增强(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1可通过上调PP2A活性和下调GSK-3β活性从而减轻凝聚态Aβ25～35所诱导的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.
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山茱萸环烯醚萜苷对冈田酸拟阿尔茨海默病细胞模型PP2A催化亚基C磷酸化及其调节酶Src的影响
微管相关蛋白tau的异常过度磷酸化是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要发病机制之一,蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatases 2A,PP2A)能够促进tau蛋白的去磷酸化.山茱萸环烯醚萜苷(CIG)是本室从山茱萸中提取的主要有效部位.本实验的目的是研究CIG对PP2A活性及其相关调节酶的影响,应用PP2A抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)与人神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH细胞)孵育制备拟AD细胞模型;采用PP2A试剂盒测定细胞内PP2A的活性;应用Western blot方法检测tau蛋白磷酸化、PP2A催化亚基C(PP2Ac)和Src的表达.结果显示:OA与SK-N-SH细胞孵育6h后,显著增高tau蛋白的磷酸化水平,降低PP2A活性,增高PP2Ac和Src的磷酸化水平.CIG与细胞预孵育24 h能够明显抑制OA模型细胞tau蛋白在Ser 199/Ser 202位点和Ser396位点的过度磷酸化,恢复PP2A活性,抑制PP2Ac在Tyr307位点的过度磷酸化和Src在Tyr416位点的过度磷酸化.提示CIG通过抑制Src在Tyr 416位点的磷酸化降低其活性而抑制PP2Ac的磷酸化,从而恢复PP2A活性,促进tau蛋白的去磷酸化,终抑制tau蛋白异常过度磷酸化.结果说明CIG可能有利于治疗AD.
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马钱苷通过抑制蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化降低tau蛋白过度磷酸化
目的 探讨马钱苷对tau蛋白过度磷酸化的影响及其作用机制.方法 马钱苷(500、1 000 μmol/L)与入神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH细胞)预孵育24 h,之后加入PI3K抑制剂Wortmannin(WT)及PKA抑制剂GF-109203X(GFX)与SK-N-SH细胞孵育3h,采用Western blotting方法观察马钱苷对tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的磷酸化,GSK-3β-Ser9、GSK-3β、PP2A催化亚基C(protein phosphatase 2A catalytic subunit C,PP2Ac)磷酸化/甲基化及PP2Ac的表达.结果 WT/GFX明显抑制p-GSK-3β-ser9的表达,引起GSK-3β活性增高,从而导致tau蛋白Thr205、Thr217、PHF-1位点高度磷酸化.马钱苷能够明显抑制模型细胞tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的过度磷酸化,但是不能增高p-GSK-3β-ser9的表达,提示马钱苷抑制tau蛋白磷酸化的作用不是通过影响GSK-3β通路实现的.但是实验显示马钱苷能够抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,但对Leu309位点甲基化无影响.结论 马钱苷能够抑制tau蛋白过度磷酸化,机制可能与其抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,提高PP2A活性有关,与GSK-3β通路无关.
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血清蛋白磷酸酯酶2A水平与卵巢癌患病的相关性研究
目的 在血清学水平探讨卵巢癌患者蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatase,PP2A)蛋白表达水平及其与卵巢癌肿瘤标志物糖链抗原125(sugar chain antigen 125,CA125)和人附睾蛋白4(human epididymal protein 4,HE4)水平的相关性.方法 分别选取正常对照组30例,卵巢囊肿15例,卵巢癌患者20例进行研究.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清PP2A蛋白表达水平.结果 与正常对照组相比,卵巢囊肿组血清PP2A水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05),同时PP2A酶活性下调,PP2A活性仅为正常对照组的80％,差异有统计学意义(P＜0.05);卵巢癌组血清PP2A水平下降明显,差异有统计学意义(P＜0.01),同时酶活性显著下调,PP2A酶活性仅为正常组的65％,差异有统计学意义(P＜0.01).与卵巢囊肿组相比,卵巢癌组血清PP2A水平下调,差异有统计学意义(P＜0.05),酶活性水平下调,差异有统计学意义(P＜0.05).进一步做血清PP2A水平与肿瘤标志物相关性分析,结果显示无论是卵巢囊肿组还是卵巢癌组PP2A与CA125及HE4均无相关性,仅 卵巢癌组中CA125和HE4呈正相关(P＜0.01).结论 卵巢癌患者血清中PP2A蛋白表达水平显著下降,血清中PP2A水平与CA125及HE4均无相关性,提示血清中PP2A水平可能为卵巢癌独立的危险因素,检测患者血清PP2A水平可早期预测卵巢癌.
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Tau蛋白在血管性痴呆发病机制中的作用
目的 观察血管性痴呆中Tau蛋白表达和磷酸化程度,研究其在发病机制中的可能作用.采用持久性双侧颈总动脉结扎方法制备血管性痴呆模型,Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力的差异,HE染色和免疫组化染色检测海马CA1区Tau蛋白、蛋白磷酸酯酶2A的表达情况.结果发现手术组与对照组大鼠相比,Morris水迷宫隐藏平台逃避潜伏期延长,空间摸索试验时间减少;海马CA1区细胞排列疏松,数目减少,细胞形态异常;手术组大鼠神经元中Tau蛋白含量增多,蛋白磷酸酯酶2A减少,以一个月时明显.以上结果表明Tau蛋白表达增多及过度磷酸化在血管性痴呆发病机制中可能起到作用.
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人参皂甙Rb1减轻冈田酸诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化
为研究人参皂甙Rb1(ginsenoside Rb1)对冈田酸(okadaic acid,OA)诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化的影响及其可能机制,实验随机分为正常组、溶媒对照组、OA模型组和Rb1预处理组.正常组不作任何处理;Rb1预处理组大鼠分别用5、10、20 mg/kg的Rb1预处理,每天一次,共14 d,于第13天向海马背侧注射1.5μl OA[0.483μl,溶于10%二甲基亚砜(dimethysulphoxide,DMSO)];OA模型组大鼠于第13天时海马背侧注射OA,溶媒对照组则注射等体积的生理盐水.各组均于第15天收取标本.通过Bieschowski's染色、免疫组化和Western blot,分别观察大鼠海马神经元胞体和突起内神经原纤维的改变和磷酸化Tau蛋白的表达水平,同时检测蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)活性以探讨其作用机制.结果显示:(1)OA模型组与溶媒对照组及正常组比较,海马神经元胞体和突起着色较深,染色不均匀;神经元中Thr231和Ser396位点磷酸化的Tau蛋白和总Tau含量增多;PP2A活性则明显下降(P＜0.01);(2)Rb1预处理组大鼠海马神经元胞体和突起染色均匀,神经原纤维走行规则;海马神经元中Thr231和Ser396位点磷酸化的Tau蛋白和总Tau含量较OA模型组减少,而PP2A活性明显增高(P＜0.01).以上观察结果表明,人参皂甙Rb1可以减轻OA诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化,其机制可能与提高PP2A活性有关.
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白细胞介素-10对冈田酸诱导的阿尔茨海默病模型大鼠的保护作用
目的:观察细胞因子白细胞介素-10(IL-10)预处理对阿尔茨海默病(Alzheimer' disease,AD)模型鼠行为学和分子生化改变的保护作用,并探讨其机制.方法:SD大鼠海马微量注射冈田酸(okadaic acid,OA)及IL-10建立AD模型.用水迷宫检测大鼠逃避潜伏期；用Western blot方法检测海马匀浆中蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A)和淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein,APP)的表达量；用流式细胞术检测肠系膜淋巴细胞中的CD4+细胞数与CD8+胞数的比值.结果:大鼠海马注射OA后,动物的水迷宫逃避潜伏期时间增加,且高浓度OA组水迷宫逃避潜伏期时间均长于低浓度OA组;海马内PP2A蛋白的表达下调,且随着OA浓度的加大,对PP2A蛋白表达的抑制作用加强,APP蛋白的表达增强,且随着OA浓度的加大,对APP蛋白表达的增强作用更明显.IL-10与OA注射人大鼠海马后,动物的水迷宫逃避潜伏期时间明显少于仅注射OA的AD模型动物；IL-10能够逆转OA引起的PP2A蛋白表达减少,对抗OA引起的APP蛋白表达增加；IL-10可使OA诱导的CD4+/CD8增加翻转到对照水平.结论:大鼠海马多次微量注射OA可诱导大鼠产生AD样病变,即可诱导AD模型,IL-10可以抑制OA诱导的大鼠产生AD样病变,IL-10的这种作用与它抑制炎症反应有关.
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脑益康对阿尔茨海默病大鼠tau蛋白过度磷酸化及其相关酶类表达的影响
目的 探讨脑益康对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马神经元tau蛋白过度磷酸化及其相关酶类表达的影响.方法 采用β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)右侧海马注射制备AD大鼠模型,免疫组化法和Western blot法检测大鼠海马神经元tau蛋白在Serd04位点的磷酸化水平、蛋白磷酸酯酶2A(PP-2A)的表达情况,ELISA法检测糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白的水平.结果 AD模型组大鼠海马组织p-tau(Ser404)、GSK-3β表达增加,PP-2A表达减少,与假手术组的差异有高度统计学意义(P<0.01);脑益康治疗组大鼠的p-tau(Ser404)、GSK-3β表达显著减少,PP-2A表达显著增加,差异均有高度统计学意义(均P<0.01).结论 脑益康可通过增加PP-2A的表达和抑制GSK-3β的表达减轻AD模型大鼠tau蛋白的过度磷酸化.
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上调蛋白磷酸酯酶2A水平可显著抑制宫颈癌细胞迁移
目的:探讨蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)在宫颈癌迁移中的作用.方法:培养Hela宫颈癌细胞,通过药物或质粒转染干预PP2A水平.药物实验中将Hela细胞分为3组,即正常对照组(DMSO处理,n=6),DES组(10nM PP2A激动剂DES处理,n=6)和OA组(10nM PP2A抑制剂OA处理,n=6);质粒转染实验中将Hela细胞分为DsRed-vector组(n=6),DsRed-PP2Ac组(n=6)和DsRed-siPP2Ac组(n=6),按分组要求转染相应质粒.采用划痕实验观察各组不同时间点(药物0h、24h、48h;转染0h、48h) Hela细胞迁移情况并比较组间差异.结果:药物或基因上调PP2A可显著抑制宫颈癌细胞的迁移,而药物或基因下调PP2A水平则明显促进宫颈癌细胞的迁移.结论:PP2A在宫颈癌的发展中起重要的作用,该研究可为宫颈癌的发展提供新的分子机制,亦可为宫颈癌临床药物的开发提供新的靶点.
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阻断酪氨酸蛋白激酶Src表达对蛋白磷酸酯酶2A活性和tau蛋白磷酸化的影响
目的:研究细胞内酪氨酸蛋白激酶Src对蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)酪氨酸307位点(Y307)磷酸化和活性以及tau蛋白磷酸化的影响,为阿尔茨海默病脑内PP2A活性下调和tau蛋白异常磷酸化机制提供实验依据.方法:体外培养小鼠成神经瘤N2a细胞,转染特异性阻断Src表达的SiRNA,检测转染不同时间点PP2A Y307的磷酸化水平、PP2A的活性以及tau蛋白在不同位点的磷酸化水平.结果:转染Src SiRNA 12 h时Src蛋白水平显著降低,PP2A Y307的磷酸化水平下降,但总的PP2A蛋白水平也降低,伴随PP2A活性下调,tau蛋白在Ser198/199/202位点发生过度磷酸化.结论:细胞内PP2A活性的调节受多种因素的影响,单纯阻断上游Src的表达可降低PP2A的活性,并导致tau蛋白的过度磷酸化.
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基因水平下调PP2A水平可显著抑制海马神经元轴突生长
目的 探讨基因水平下调PP2A对胎鼠海马神经元轴突生成的影响.方法 选取体外培养原代海马神经元为研究模型,首先构建PP2A催化亚基特异性干扰RNA及其对照(si-PP2A/ssi-PP2A)质粒,选择在种植前下调PP2A水平,观察其对海马神经元轴突生成是否有作用;原代细胞采用Amaxa大鼠神经元核电转试剂盒分别转染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac,神经元种植培养48 h后固定做免疫荧光双标,分别标记轴突特异性标记物Tau-1和树突特异性标记物MAP-2,观察基因下调PP2A水平对神经元轴突生成的影响.结果 原代海马神经元转染48 h后对照转染组海马神经元神经元轴突和树突均已形成,而干扰RNA转染组神经元轴突生长受到显著抑制,而树突生长未受到明显影响;si-PP2A转染组(干扰转染组)神经元轴突长度仅为对照转染组的38%,单个神经元的平均轴突数目也从正常1.0/neuron下降到0.5/neuron.结论 基因下调PP2A水平显著抑制了原代海马神经元轴突生成,结合前期药物下调研究结果提示维持细胞内正常PP2A水平在海马神经元轴突生成中起重要作用.
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Meynert基底核注射冈田酸致大白鼠空间记忆障碍
目的:研究蛋白磷酸酯酶2A (PP2A)下调能否引起大白鼠空间记忆障碍.方法:向大白鼠Meynert基底核注射冈田酸(OA) 0.4 μmol,检测PP2A、PP1的活性,脑内乙酰胆碱(Ach)水平及大白鼠空间记忆.结果:OA 0.4 μmol对PP2A活性的抑制率约60.0%,可致大白鼠空间记忆缺损,注射后24 h鼠脑Ach水平降低.结论:PP2A的下调在阿尔茨海默病(AD)病理变化中起着重要的作用.
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内质网应激抑制剂4-PBA预处理对脑死亡致供肝细胞凋亡的影响及临床意义
目的:探讨脑死亡时肝脏组织内内质网应激的活化对供肝质量的影响及其机制.方法:健康成年雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组(S组)、脑死亡组(BD组)及脑死亡十内质网应激抑制剂4-苯丁酸(4-PBA)组(PBA组),每组10只.S组大鼠麻醉后行股动脉置管、颅骨钻孔置管及气管插管,但不行颅内加压.BD组大鼠行股动脉置管、颅骨钻孔置管及气管插管,采用渐进式颅内加压的方式建立大鼠脑死亡模型.PBA组在脑死亡模型建立后腹腔注射给予内质网应激抑制剂4-PBA.S组大鼠维持麻醉6h,BD、PBA组大鼠脑死亡维持6h后分别取各组大鼠肝脏标本行TUNEL凋亡检测及Western Blot检测内质网应激相关蛋白及蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)表达量.结果:TUNEL凋亡检测:与S组相比,BD组及PBA组肝脏细胞凋亡率明显升高,且BD组凋亡率明显高于PBA组.Western Blot检测:与S组相比,BD组及PBA组肝脏标本内质网应激相关蛋白CHOP、ATF6及Grp78表达量均明显升高,且BD组明显高于PBA组.而BD组及PBA组PP2A磷酸化水平明显降低,且PBA组明显低于BD组.结论:脑死亡时供肝细胞凋亡增加,同时内质网应激及PP2A活性均升高,抑制内质网应激的活化程度后PP2A活性也出现下降,提示内质网应激可能是通过PP2A导致肝细胞凋亡.
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纤丝状Aβ42对GSK-3β和PP2A Cα表达的影响
目的探讨纤丝状Aβ42对GSK-3β和PP2A Cα表达的影响.方法应用立体定向技术对15月龄雄性SD大鼠进行海马内注射纤丝状Aβ42或双蒸水,采用免疫组织化学染色方法,观察海马神经元GSK-3β和PP2A Cα的表达改变,并进行图像分析.结果Aβ42组海马神经元GSK-3β的表达明显高于双蒸水组,但两组的海马神经元PP2ACα的表达没有明显差异.结论纤丝状Aβ42能使海马神经元GSK-3β表达上调,而对PP2A Cα的表达没有明显影响,提示纤丝状Aβ42诱导tau蛋白过度磷酸化可能与GSK-3β表达上调有关.
关键词： β-淀粉样肽 糖原合成酶激酶-3β 蛋白磷酸酯酶2A Tau蛋白 过度磷酸化 -
血清蛋白磷酸酯酶2A 水平与宫颈癌的相关性研究
目的：宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，本研究拟在血清学和组织学水平共同探讨宫颈癌患者蛋白磷酸酯酶2 A （P P2 A ）水平的变化。方法分别选择同期宫颈无病变健康体检者（健康对照组）30例，高危型人乳头瘤病毒（hsHPV）感染患者17例和宫颈癌患者23例，采用酶联免疫吸附试验检测血清PP2A蛋白表达水平；另选取健康对照者24例，hsHPV感染患者18例和宫颈癌患者14例，采用酶活试剂盒检测组织PP2A活性。结果与健康对照组相比，hsHPV感染组血清PP2A水平下降，差异有统计学意义（P＜0．05），同时组织 PP2A酶活性下调，PP2A活性仅为健康对照组的66％，差异有统计学意义（P＜0．05）；宫颈癌组血清 PP2A水平下降明显，差异有统计学意义（P＜0．05），同时组织酶活性显著下调，PP2A酶活性仅为健康对照组的45％，差异有统计学意义（P＜0．05）。与hsHPV感染组相比，宫颈癌组患者血清PP2A水平下调差异有统计学意义（P＜0．05），组织酶活性水平下调差异也有统计学意义（ P＜0．05）。结论宫颈癌患者血清 PP2A蛋白表达水平显著下调，同时组织学水平PP2A酶活性亦下降。该研究结果为宫颈癌发病机制提供了新的资料，为宫颈癌的早期诊断提供了新的靶标分子。
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锂对慢性铝暴露大鼠脑内CDK5和PP2A表达的影响
目的 研究锂对慢性铝暴露大鼠脑内周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)表达的影响,进一步探讨锂抑制tau蛋白磷酸化的作用机制.方法 慢性铝暴露大鼠12只,随机分为锂治疗组和非治疗组.锂治疗组给予氯化锂[200mg/(kg·d)]溶液连续灌胃6周;非治疗组以等量生理盐水灌胃.另取6只同月龄非铝暴露大鼠为正常对照组.Morris水迷宫测试3组大鼠学习记忆功能;Western blotting检测大鼠大脑皮层及海马磷酸化tau蛋白、CDK5、PP2A的表达.结果 慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显高于正常对照组大鼠(P<0.05),且慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量与CDK5表达呈正相关(r=0.702,P=0.036).锂治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显低于非治疗组(P<0.05),且锂治疗组大鼠脑内CDK5表达与磷酸化tau蛋白含量呈正相关(r=0.871,P=0.024),而正常组、锂治疗组和非治疗组大鼠皮层及海马PP2A含量无明显差异(P>0.05).结论 抑制脑内CDK5表达可能是锂降低tau蛋白过度磷酸化,减少大鼠脑内神经原纤维缠结的又一途径.
关键词： 阿尔茨海默病 锂 Tau蛋白磷酸化 周期蛋白依赖性激酶5 蛋白磷酸酯酶2A
