结直肠癌中端粒酶催化亚单位的表达及其在预后判断中的意义

端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响

背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用.本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用.方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT).分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISAPCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响.结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止.asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止.ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶.其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P＜0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P＜0.001).结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点.

端粒酶催化亚单位(hTRT)基因在人胃癌组织中的表达

随着端粒酶研究的不断深入,端粒酶的三个亚单位相继被克隆测序 , 即端粒酶 RNA(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶相关蛋白 1( telomerase associated protein 1, TP1)、端粒酶催化亚单位( human telomerase reverse transcriptase, hTRT).研究表明, hTRT基因可能是调节端粒酶活性的主要因素 [1].本研究旨在探讨胃癌组织中端粒酶 hTRT基因表达水平与临床病理的关系,建立检测人胃癌组织细胞中端粒酶基因的有效方法.

人胃癌组织端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的相关性

[目的]探讨胃癌组织中端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的关系.[方法]采用改良端粒重复扩增法(TPAP)和RT-PCR扩增法检测胃癌组织、胃溃疡组织、正常胃黏膜中端粒酶活性和hTRT基因表达.[结果]58例胃癌组织中51例(88%)有hTRT基因表达,50例(86%)检测到端粒酶活性,58例非胃癌组织中,3例有hTRT基因表达,无l例检测到端粒酶活性.[结论]hTRT基因表达与端粒酶活性的表达具有高度一致性.

胃癌前病变组织和胃癌中hTERT的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系

目的探讨胃癌前病变组织及胃癌中人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)的表达状况及其与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的关系.方法应用免疫组织化学技术检测45例慢性胃炎和19例胃癌中hTERT蛋白的表达,用快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色法检测Hp.结果 hTERT蛋白的表达率在胃癌组织(78.95%)中显著高于异型增生(64.29%,P＜0.05)、肠化生(46.67%,P＜0.05)和萎缩性胃炎组织(25.00%,P＜0.05),在异型增生组织(64.29%)中显著高于肠化生(46.67%,P＜0.05)和萎缩性胃炎组织(25.00%,P＜0.05),在肠化生组织(46.67%)中显著高于萎缩性胃炎组织(25.00%,P＜0.05).Hp阳性患者中hTERT蛋白的表达率为77.42%,Hp阴性患者中hTERT蛋白的表达率为33.33%,二者之间差异非常显著(P＜0.01).结论在胃癌和胃癌前病变阶段,端粒酶(telomer-ase)均可能发挥重要作用,促进了胃癌的发生、发展.Hp可能是胃粘膜上皮细胞端粒酶激活的主要机制之一.

肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用的研究

目的 研究肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用.方法 用脂质体法将人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控的肿瘤特异性表达载体hTERT-Caspase-8,瞬时转染端粒酶阳性的食管癌细胞株Eca109及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5.结果 转染hTERT-Caspase-8对细胞Eca109的生长具有显著抑制作用,细胞凋亡水平显著升高;转染hTERT-Caspase-8对MRC-5的生长和凋亡均无明显影响.结论 上述发现提示hTERT启动子可以调控Caspase-8基因在食管癌细胞中靶向性表达,选择性抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件.

端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv-tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究

目的 研究人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir, Hsv-tk/GCV)治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用.方法 (1)用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的tk基因表达质粒(pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk)转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,用逆转录-PCR方法检测转染细胞中tk基因的表达情况; (2)用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用; (3) 用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响. 结果 (1)转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549均有tk mRNA表达,转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tk mRNA表达; (2)GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无明显抑制作用; (3) 转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞,GCV处理后细胞凋亡指数(21.58%、9.35%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞(0.78%和0.55%)及空白对照A549和MRC-5细胞(2.17%和0.60%),转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高.结论 hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达,hTERT调控的Hsv-tk/GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用.

端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞的实验研究

目的探讨端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞后,血管内皮细胞增生活性的变化.方法应用胶原酶消化法培养脐静脉血管内皮细胞(UE),ABC法检测内皮细胞CD34表达.脂质体介导内皮细胞转染,MTT法测定细胞代谢活性并测定细胞生长曲线.基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法检测端粒酶活性表达.结果培养的细胞贴壁后为单层呈铺路石状排列.细胞爬片CD34染色呈阳性,pBABE-HYGRO-hERT转染内皮细胞测定端粒酶活性的吸光度为0.889.MTT实验表明:在各个时间点转染阳性细胞(HC)的吸光值都高于脐静脉血管内皮细胞(UE)(P<0.05).UE与HC的细胞生长曲线形态相似,8 d内HC数量增长了约4倍.在各个时间点HC较UE细胞数多(P<0.05).结论 pBABE-HYGRO-hTERT转染内皮细胞后,提高了内皮细胞端粒酶的活性和增殖能力.

幽门螺杆菌培养液对SGC7901胃癌细胞表达hTERT和Bcl-2的影响

目的 研究幽门螺杆菌(HP)培养滤液对SGC7901胃癌细胞表达hTERT、Bcl-2蛋白的影响.方法 在HP培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测SGC7901胃癌细胞hTERT、Bcl-2蛋白的表达.结果 对照组SGC7901胃癌细胞表达hTERT和Bcl-2蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于经HP培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05).经HP培养滤液处理的SGC7901胃癌细胞24、36、48 h表达hTERT和Bcl-2蛋白的阳性细胞数和荧光指数呈递增趋势,且相互间有显著差异(P<0.05).结论 HP感染不仅通过激活端粒酶促进细胞永生化,而且通过促进Bcl-2表达使细胞凋亡减少,进而促进胃癌的发生、发展,这可能是HP感染致癌的重要机制之一.

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的 研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果.方法 ①用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;②MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;③将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用.结果 ①转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;②GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK 和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照, 转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;③pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%).结论 hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用.

口腔黏膜癌变过程中端粒酶催化亚单位和c-myc表达研究

目的探讨在口腔黏膜癌变过程中端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和c-myc 的表达及其相关关系.方法用免疫组化的方法对口腔白斑(oral leukoplakia,OLK)45例(单纯性增生15例,轻度异常增生10例,中度异常增生11例,重度异常增生9例)、口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)37例(OSCC Ⅰ级13例、OSCCⅡ级12例、OSCCⅢ级12例)和正常口腔黏膜12例进行了hTERT和c-myc的检测.结果正常口腔黏膜组、单纯增生性白斑组、不典型增生性白斑组及鳞癌组hTERT蛋白表达的阳性率分别为:0%(0/12)、26.67%(4/15)、56.67%(17/30)、83.78%(31/37),上述四组间hTERT蛋白表达阳性率有差异(P＜0.01).正常口腔黏膜组、单纯增生性白斑组、不典型增生性白斑组和口腔鳞癌组之间c-myc蛋白表达阳性率也有显著性差异(P＜0.01),且hTERT蛋白和c-myc蛋白的表达有明显的正相关关系.结论hTERT和c-myc的表达在口腔黏膜癌变过程中起重要作用,且c-myc的表达是活化hTERT基因的启动因子之一.

HP培养滤液诱导下抑制bcl-2基因表达对SGC7901细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨bcl - 2表达与hTERT、端粒酶活性之间的调控关系,了解HP的致癌机制.方法:在HP培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测bcl - 2AODN抑制bcl - 2基因之后人SGC7901细胞hTERT蛋白的表达.结果:对照组人SGC7901细胞24 h、36 h和48 h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于经HP培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P＜0.05).在HP滤液诱导下,抑制bcl - 2基因的SGC7901胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于与SGC7901胃癌细胞 (P＜0.05),同时显著高于对照组(P＜0.05).结论:bcl - 2基因正向调控hTERT蛋白表达,bcl - 2表达上调可能是端粒酶活化的主要途径之一.端粒酶的激活不完全依赖于bcl - 2途径,还存在其他的调控因素.HP感染不仅通过上调bcl - 2的表达,还可以通过其他途径激活端粒酶,这可能是HP感染致癌的一条重要途径.

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC7901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系,了解Hp的致癌机制.方法:在Hp培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达.结果:对照组SGC7901胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P＜0.05).在Hp滤液诱导下,抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异(P＞0.05).结论:Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达,这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一.端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达.

hTERT基因反义核酸对Hela宫颈癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因的反义寡核苷酸对宫颈癌细胞的影响.方法:采用TRAP-ELISA检测Hela细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化.结果:hTERT基因反义核酸能有效抑制Hela细胞端粒酶活性.结论:hTERT基因反义核酸能显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为肿瘤治疗提供了一个有效的新途径.

端粒酶催化亚单位TERT在实验性外伤性PVR视网膜前膜的动态表达

目的:探讨端粒酶催化亚单位(TERT)是否参与了实验性外伤性增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)视网膜前膜的细胞增殖调控及其随病程的动态变化.方法:对外伤性PVR大鼠模型视网膜前膜做S-P 法TERT免疫组织化学染色和HE染色,染色结果行计算机图像分析.结果:术后7,14,21,28d视网膜前膜阳性细胞率出现先升高后略降,分别为(4.5±2.7)%,(14.2±4.6)%,(13.0±4.8)%,(9.2±2.3)%,平均A分别为0.0690±0.0213,0.0912±0.0125,0.0825±0.0278,0.0744±0.0159,7d组与14d组和21d组比较有显著性差异,28d组较前2组阳性率下降,差别有显著性意义.结论:端粒酶的激活可能是启动PVR视网膜前膜细胞增殖的机制之一,TERT的表达随病程而出现波动.

涎腺肿瘤中hTERT mRNA表达的研究

目的:探讨端粒酶逆转录酶(hTERT) 在涎腺肿瘤中的表达及意义.方法:采用原位杂交技术检测83 例涎腺组织石蜡切片标本hTERT mRNA 的表达,包括正常涎腺对照组10 例,良性肿瘤30 例,恶性肿瘤43 例,并分析其与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位和组织学分化程度之间的关系.结果:对照组涎腺组织hTERT mRNA的阳性表达率为0%(0/10),良性肿瘤hTER mRNAT的阳性表达率为3.3%(1/30),恶性肿瘤hTERT mRNA阳性的表达率为83.7%(36/43).hTER mRNA在涎腺肿瘤良性、恶性中的表达差异具有统计学意义(P＜0.05).hTERT mRNA 在涎腺恶性肿瘤组织中的表达与患者性别、年龄、以及肿瘤大小、部位、分化程度无相关性.结论: hTERT mRNA表达的检测可以作为鉴别涎腺良恶性肿瘤的良好指标.

hTERT基因反义核酸对人卵巢癌细胞 HO-8910存活能力的影响

目的: 研究互补于人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因的反义寡核苷酸对人卵巢癌HO-8910细胞存活能力的影响. 方法: 采用台盼蓝排斥试验、裸鼠成瘤性观察等方法检测HO-8910卵巢癌细胞在反义核酸处理后细胞存活能力的变化. 结果: 针对hTERT基因反义核酸能显著降低肿瘤细胞的存活能力,反义核酸作用后的HO-8910细胞不能诱发裸鼠肿瘤. 结论: 将直接针对hTERT基因的反义分子作用于体外培养的人卵巢癌细胞HO-8910,能有效降低细胞生存能力,导致细胞死亡.

食管癌组织hTERT和c-Myc的表达

目的: 探讨食管癌及癌前病变组织中端粒酶催化亚单位(hTERT)基因及c-Myc蛋白的表达以及相互关系. 方法: 采用原位杂交法检测42例食管癌组织、37例不典型增生组织及12例正常食管组织中hTERTmRNA的表达;用免疫组化S-P法检测c-Myc蛋白表达. 结果: 在正常食管粘膜-不典型增生-食管癌组织中,hTERTmRNA的阳性表达率分别为0,48.6%, 83.3%; c-Myc蛋白阳性表达率分别为0,45.9%, 59.5%. 食管癌、不典型增生组织中hTERTmRNA与c-Myc蛋白阳性表达率较正常食管粘膜组织差异有显著性(P<0.01, P＝0.002, P<0.01, P＝0.004), 癌组织中hTERTmRNA阳性表达率较不典型增生组织差异有显著性(P＝0.002). 食管癌组织中hTERTmRNA表达与临床分期、淋巴结转移有关 (P＝0.01,P＝0.044), c-Myc蛋白表达与淋巴结转移有关(P＝0.026); 结果还显示hTERTmRNA和c-Myc蛋白表达具有相关性(P<0.01). 结论: c-Myc蛋白与hTERT基因的过度表达在食管癌的发生发展过程中具有重要作用, c-Myc蛋白在转录水平上调控hTERT基因的表达,激活端粒酶,可能是食管癌发生发展的重要阶段.

hTERT基因反义核酸对8910卵巢癌细胞端粒酶活性的影响

目的研究人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因的反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的影响. 方法采用TRAP-ELISA检测8910卵巢癌细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化. 结果 hTERT基义反义核酸能有效抑制8910细胞端粒酶活性. 结论 hTERT基因反义核酸能显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径.

靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的 观察靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用.方法 从Genebank中钓取人端粒酶催化亚单位基因hEST2的mRNA序列,通过计算机模建二级结构辅助设计并合成硫化修饰反义寡核苷酸(癌泰得).采用人肝癌裸小鼠原位移植模型(HCM-Y89).实验分为生理盐水组,5-FU 10 mg/kg组,癌泰得50 mg/kg组、75 mg/kg组,癌泰得75 mg/kg联合5-FU 10 mg/kg组、50 mg/kg联合5-FU 10 mg/kg组.尾静脉给药,每天1次,连续20 d.观察移植瘤质量和抑瘤率、移植瘤体积、AFP浓度和移植瘤组织学.结果 (1)5-FU 10 mg/kg组的抑瘤率为27.85%,其他各治疗组的抑瘤率均在42.14%～74.29%之间;(2)各治疗组瘤质量、瘤体积和AFP浓度均低于生理盐水组且差异有统计学意义;(3)瘤体积和AFP浓度之间呈直线关系,为显著正相关(r=0.997 7);(4)癌泰得和5-FU治疗人肝细胞癌后,肝癌细胞出现不同程度的凋亡、坏死,同时伴有纤维组织增生.结论 癌泰得对肝癌细胞生长具有抑制作用,疗效优于5-FU;与5-FU合用具有协同抗肿瘤效应.