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野生白化喜马拉雅旱獭重要病原体检测与控制研究
目的 调查白化旱獭重要病原体的自然感染状况,为建立白化旱獭寄生虫和微生物学质量控制标准提供依据.方法 在白化旱獭原产地对21只野生的白化旱獭和30只正常毛色旱獭采用虫体检查法、粪便检查法和血清学方法检测体内外寄生虫、鼠疫菌、布鲁氏菌、土拨鼠肝炎病毒等重要病原体感染情况. 结果 51只野生白化喜马拉雅旱獭和正常毛色旱獭检出体外寄生虫5种、蠕虫1种,感染率分别为:斧形盖蚤(C.dolabris)(85.71 ％/93.33％)、谢氏山蚤(O.silantiewi)(90.48％/90.0％)、腹窦纤蚤深广亚种(R.ventrasa) (71.43％/96.67％)、古北拟额虱(L.laeviusculus)(85.71 ％/86.67％)、草原硬蜱(I.crenulatus)(100.00％/96.67％)和蛔虫(A.tarbagan)(71.43％/66.67％),白化和正常毛色旱獭寄生虫感染情况进行了确切概率法检验,两者除腹窦纤蚤深广亚种(Pα =0.0151＜0.05,P单=0.0151＜0.05)感染率差异有统计学意义外,其余4种体外寄生虫和蛔虫感染率差异均无统计学意义(P均＞0.05);弓形虫、棘球蚴、鼠疫菌、布鲁氏菌和土拨鼠肝炎病毒抗体均为阴性.应用菊酯类气雾剂、阿苯达唑片剂和伊维菌素注射液进行了旱獭体内寄生虫驱虫和净化,并比较了药物驱虫前后动物血液生理生化指标的变化以评价驱虫药物对旱獭的毒性,驱虫前后各项生理生化指标差异均无统计学意义(P均＞0.05);结合产地检疫、隔离和优选技术建立了白化旱獭人工种群;加强人工驯养综合饲养管理,对种群动物定期监测人兽共患病原体和旱獭重要传染病病原体的抗体水平,监测结果均为阴性.结论 参照普通级实验动物微生物和寄生虫控制标准,白化旱獭排除了体内外寄生虫、重要人兽共患病和旱獭传染病等病原体感染,微生物和寄生虫学质量达到了普通级实验动物的基本要求.
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土拨鼠肝炎病毒核心蛋白的高效表达和B细胞表位鉴定
目的 建立高效表达土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg)的方法并对其B细胞表位进行鉴定.方法 分别构建不同截短型WHcAg的质粒以了解能大量表达并形成WHV核心颗粒的区段,利用变性WHcAg制备单克隆抗体以寻找能与WHcAg线性B细胞表位结合的单克隆抗体.结果 WHcAg前144或149氨基酸残基能够大量表达并能形成颗粒样结构.这2种截短型WHcAg能够在大肠杆菌中表达并组装成直径为34 nm的核心颗粒,终纯化获得毫克级的核心蛋白.截短型WHcAg保留了全长WHcAg的抗原性,而且变性WHcAg存在另外的B细胞线性表位,利用变性WHcAg进行免疫制备单克隆抗体获得的5株抗体均针对WHcAg的N末端表位,该表位在WHcAg和HBcAg高度保守.结论 建立了高效表达WHcAg的方法,制备了针对WHcAg单克隆抗体.并对WHcAg的线性B细胞表位进行了鉴定,发现WHcAg和HBcAg的N末端存在共同的线性B细胞表位.
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HBV与HCV感染及相关标志物
一、HBVHBV是嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnavirus)的一员,该属其他成员包括土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)及地松鼠肝炎病毒(dround squirrel hepatitis virus,GSHV).鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus,DHBV)则属于同科中禽嗜肝DNA病毒属(avihepadnavirus).
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抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用
目的:研制出能特异与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHc)结合的单克隆抗体,使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒(WHV)进行检测,并可能应用于相关肝炎病毒的筛查.方法:以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白(WHc 1～149氨基酸)免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,有限稀释法克隆化,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组织化学(IHC)筛选、鉴定.结果:筛选出5株(4B1E、6C5D、6C5C、6D1D、6D1G)能稳定分泌抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白抗体的杂交瘤细胞株.此5株单抗适用于ELISA、IHC、Western blot等方面的研究,与HBcAg有交叉反应,并且在部分中国旱獭的肝脏组织进行IHC检测呈现阳性反应.结论:制备的5株单抗可用于土拨鼠肝炎病毒等嗜肝脱氧核糖核酸病毒的研究,可能在寻找新的相关肝炎病毒中起重要作用.
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土拨鼠肝炎病毒可复制性克隆的构建和鉴定
HBV慢性感染迄今仍缺乏特效的治疗措施,其中主要原因之一是缺乏完善的体内和体外复制系统.土拨鼠肝炎病毒(WHV) 发现于1978年[2],与HBV同属于正嗜肝病毒.研究发现,WHV在形态学、基因组结构、基因产物、复制过程、流行病学、感染过程及致病、致癌等方面都与HBV非常相似.目前,土拨鼠-WHV模型是人类HBV感染较理想的动物模型,已经用于疫苗开发、治疗性疫苗和抗病毒药物的研究,以及病毒生活周期、致病致癌分子机制的研究 [3].
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Toll样受体激动剂抑制土拨鼠肝炎病毒作用研究
目的 研究Toll样受体(TLR)激动剂对土拨鼠肝炎病毒(WHV)复制的抑制作用.方法 从WHV慢性感染的土拨鼠肝脏分离原代肝细胞,转染Poly I:C、CpG或直接用LPS刺激,Southern印迹检测WHV复制中间体,病毒保护试验检测细胞培养上清液中Ⅰ型干扰素的水平；通过尾静脉注射Poly I:C、LPS、CpG到WHV转基因小鼠体内,提取肝脏DNA和RNA,实时PCR检测MxA和OAS1的mRNA水平.结果 Poly I:C、LPS和CpG在原代土拨鼠肝细胞和WHV转基因小鼠显著抑制病毒复制；Poly I:C、LPS和CpG处理后的原代肝细胞分泌高水平的Ⅰ型干扰素,肝脏的MxA和OAS1 mRNA上调表达.结论 TLR通路的活化通过诱导Ⅰ型干扰素而发挥抗病毒作用,在抗HBV治疗中可能发挥重要作用.
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乙型肝炎病毒隐匿性感染的临床意义
隐匿性HBV感染是一种常见的、长期的急性肝炎消退后出现一种隐匿性感染.这种形式的残余感染是称为二次隐匿感染(SOI).HBV感染土拨鼠模型的样本数据表明,暴露在少量的嗜肝性DNA病毒中也可能引起病毒基因组的原发性隐匿感染(POI), 没有血清学暴露病毒被检测出,肝脏可能检测出病毒.作者总结当前对隐匿性病毒持续感染的本质和特点的理解,以对隐匿性HBV感染有新的认识.
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土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定
目的 构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备.方法 应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg1～149aa)的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白.将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5 kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应.结论 获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原(1～149aa)纯度高,免疫原性强.获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应.
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CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制
目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法.方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性.土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照.在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHsAg (WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平.结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHsAg抗原水平.CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13～17周后血清WHsAg低于检测下限.另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中MxA mRNA显著上调(10～100倍).结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用.通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法.
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土拨鼠肝炎病毒转基因小鼠模型的建立
目的:建立土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,以用于嗜肝病毒感染的发病机制研究.方法:采用微注射技术将1.3-倍WHV基因[野生型和WHV S抗原(WHV surface antigen,WHsAg)缺陷型]注射人C57BL/6xC3H小鼠的胚胎,然后与C57BL/6小鼠回交,建立WHV转基因小鼠.肝内WHVDNA复制和mRNA表达水平分别采用Southern杂交和real-time RT-PCR检测,血清中WHV病毒载量采用real-timePCR检测,HE染色进行肝组织病理学检测,ELISA检测血清中WHV核心抗体,流式细胞仪检测WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)特异性细胞毒性T淋巴细胞.结果:成功建立野生型WHV转基因小鼠和WHsAg缺陷型转基因小鼠.WHsAg缺陷型小鼠肝内WHV复制水平显著高于野生型小鼠,野生型WHV转基因小鼠血清WHV载量104～108 copies/mL.而且雄性小鼠肝内和血清WHV复制水平显著高于雌性小鼠.16周龄以上的WHV转基因小鼠约半数血清可检测出高滴度的WHV核心抗体.而且少数转基因小鼠可以检测到WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞.结论:这种新建的WHV转基因小鼠肝内可检测到病毒复制和mRNA表达,血清有高水平的WHV病毒载量,可以用于嗜肝病毒感染的发病机制、抗病毒治疗等研究.
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RNAi通过PKR和TLR通路活化天然免疫
目的:研究特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi)上调天然免疫的分子机制.方法:分别从土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠和WHV慢性感染的土拨鼠分离原代肝细胞,转染针对WHV和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),同时用特异性siRNA抑制剂和信号通路抑制剂,研究RNA活化蛋白激酶(RNA-activated protein kinase,PKR)、Toll样受体(toll-like receptor,TLR)3、7/8和视黄酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-I)/黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)等信号通路在RNAi上调天然免疫中的作用,Real-time RT PCR检测靶基因和MxA的mRNA水平,Western blot检测信号通路分子磷酸化PKR、核因子κB(Nuclear Factor κB,NF-κB)和干扰素调节因子(interferon regulator factor,IRF)3的蛋白水平.结果:针对WHV和GAPDH的RNAi介导的黏病毒抵抗蛋白A(myxovirus resistance A,MxA)上调可以被PKR抑制剂和内体酸化抑制剂所阻断,特异性RNAi可以诱导PKR磷酸化和NF-κB与IRF3的核内转位.结论:特异性RNAi介导的靶RNA降解产物可能通过PKR和TLR-3,-7/8通路活化天然免疫.
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RNA干扰上调天然免疫
目的:研究特异性RNA干扰对于天然免疫的上调作用.方法:分别分离WHV感染的土拨鼠和WHV转基因小鼠原代肝细胞,转染针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA.Northern blot和Real-time RT-PCR分别检测原代肝细胞中WHV、MxA、MHC Ⅰ、β-actin、GAPDH、IFN-β和IP-10的mRNA水平.结果:针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA抑制靶基因mRNA伴随MxA、MHC Ⅰ、IP-10等干扰素刺激基因的上调表达.这种干扰素刺激基因的上调表达只有在靶基因被特异siRNA降解时出现,呈剂量和沉寂效应依赖性,而且可以被siRNA特异性抑制剂所阻断.结论:RNAi上调天然免疫可能增强siRNA的抗病毒效应,有可能在抗病毒RNAi研究中发挥重要作用.
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siRNA联合恩替卡韦在原代肝细胞中抑制土拨鼠肝炎病毒基因表达和复制
目的:在原代土拨鼠肝细胞中研究siRNA联合恩替卡韦(ETV)对土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因表达和复制的抑制作用.方法:分别设计合成针对WHV PreS1、S、C、X基因的4种siRNA,转染原代土拨鼠肝细胞,同时给予ETV处理,Southern和Northern印迹检测WHV病毒复制中间体和mRNA水平,realtime PCR检测细胞上清中WHV DNA.结果:4种siRNA对WHV基因表达和复制的作用显示出不同的动力学特征,siWHs和siWHx的抑制作用强,而siWHpreS1和siWHc的活性相对较弱.在原代肝细胞中,首先出现的是WHV mRNA水平的降低,然后是WHV复制中间体水平的降低,siWHs和siWHx高抑制60％～70％的mRNA和病毒复制中间体,同时抑制细胞上清中90％的WHV DNA.另外siWHx与EIV联合应用不仅可以增强抗病毒作用,而且可以防止ETV停药反跳.结论:siRNA在WHV自然感染的原代肝细胞中可以有效抑制病毒的基因表达和复制,因而siRNA有可能开发成为新的抗HBV药物,尤其适用于核苷(酸)类似物的联合应用.
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RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达
目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHY)序列特异性siRNA对WHVX基因表达的抑制作用.方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHVX基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3HWHx)；合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2)；质粒pXF3 H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达.结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90％以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失.结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达.
关键词： 土拨鼠肝炎病毒 土拨鼠肝炎病毒X蛋白 RNA干扰 小干扰RNA -
DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制
目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径.方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)的真核表达质粒(pWHcIm和pCG-WHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical Tcells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量.结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-IgG2a抗体和WHcAg特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制.与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2～3个Log值,其中pCGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下.结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法.
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一月龄土拨鼠肝炎病毒感染模型的建立
目的 建立土拨鼠慢性病毒性肝炎的动物模型.方法 对一月龄的土拨鼠进行颈外静脉注射感染土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV),使用两个剂量(高剂量:2.5×107 WID50;低剂量:5×106 WID50)感染,感染后在不同时间采用荧光定量PCR法测定血清中病毒DNA拷贝数,ELISA测定血清中WHsAg和WHcAb,并监测AST和ALT,肝脏活检HE染色观察病理变化,免疫组化检测WHsAg观察肝脏内病毒分布.结果 感染后16周内,土拨鼠肝脏酶学AST和ALT水平均明显升高,土拨鼠血清内病毒载量在感染后第2周开始升高,16周达到高峰期,随后,低剂量组的病毒载量开始下降,而高剂量组的病毒载量仍接近106拷贝/ml.感染动物血清内可检测到WHsAg和WHcAb,肝脏病理切片显示小灶性肝细胞坏死伴炎细胞浸润及散在出血的急性肝炎症状,胞浆内可见WHsAg阳性分布.24周时,低剂量组土拨鼠血清内WHsAg和病毒DNA无法检出,提示其为急性自限性肝炎;高剂量组土拨鼠血清内依然可检测出WHsAg和病毒DNA,提示转为慢性感染.结论 建立了急性病毒性肝炎转为慢性感染的土拨鼠模型,提示急性肝炎的病程发展除与土拨鼠感染年龄相关外,也与病毒感染剂量相关.
