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基因组DNA高通量提取技术及其在骨髓库捐献者样本HLA基因分型中的应用
本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminex rS-SO HLA流式磁珠基因分型.使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA;提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用One lambda rSSO HLA-A、B和DRBI基因分型试荆盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度.结果表明:从400μ1全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3.217±0.715μg,A260/A280值平均为1.710±0.103,A260-A320/A280-A320值平均为1.761±0.151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本HLA-A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁殊的荧光信号强度均>600 RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度<50 RFU.结论:本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验.
关键词： 基因组DNA 基因组DNA高通量提取 中华骨髓库 HLA基因分型 -
河南省骨髓库汉族捐献者HLA-A、B、DR高分辨基因多态性调查分析
背景:2009年开始,中华骨髓库加大HLA高分检测的力度,可缩短配型检索周期,提高配型成功率.目的:统计分析河南省骨髓捐献者HLA-A、B、DRB1高分辨基因多态性.方法:河南省汉族造血干细胞志愿捐献者血样3 874人份,志愿捐献静脉血,EDTA抗凝.采用SSO HD 荧光微珠流式高分辨HLA-A、B、DRB1基因分型检测方法,对3 874份骨髓捐献志愿者血样进行高分辨分型检测,用PCR-SSP高分辨检测、SBT检测解决存在的模棱两可问题.等位基因计数法计算等位基因的基因频率.结果与结论:共检出A 34个,B 84个,DRB1 50个,A位点基因频率处于前5位的有A*0201(0.160 9)、A*1101(0.162 7)、A*2402(0.160 2)、A*3001(0.080 8)、A*3303(0.078 9);B位点处于前5位的是B*1302(0.077 7)、B*4001(0.072 2)、B*5101(0.062 8)、B*4601(0.061 2)和B*0702(0.050 7);DRB1位点处于前5位的是DRB1*1501(0.146 9)、DRB1*0901(0.131 8)、DRB1*0701(0.121 1)、DRB1*1202(0.061 2)、DRB1*0405(0.058 2).
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PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A*02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析
背景:由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象.目的:统计分析基于PCR-SSO 流式荧光微珠HLA-A*02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例.方法:对河南骨髓库捐献者 1 100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A*02:01\02:09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A*02:09的基因多态性分布进行比对,找出与A*02:09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A*02:01\02:09模棱两可组合的判读方法.结果与结论:1 039例有效数据中包含A*02:01\02:09模棱两可组合279例(279/1 039,26.853%),代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A*0209的基因多态性统计显示A*0209的出现与A*11:01 (0.147 1)B*07:02(0.264 7)、DRB1*01:01(0.264 7 )、DRB1*03:01(0.117 6)有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1~7,并用SBT复核确认有1例结果为A*02:09(代码组合为GMDC),其余241例未检出A*02:09.提示 A*02:09的出现与B*07:02、DRB1*01:01、DRB1*03:01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1~7检测,可有效地检出A*02:09.通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例.
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DNA基因芯片在中华骨髓库HLA组织配型检测中的应用价值
目的 应用DNA基因芯片对中华骨髓库造血干细胞捐献者血样进行HLA-A、B、DR分型检测,探讨基因芯片应用于中华骨髓库建库的可行性.方法 常规提取血样DNA,用国际通用的方法合成PCR引物,对A、B、DR位点进行PCR扩增,电泳检测合格的扩增产物经纯化、点片、固定制成DNA芯片,用荧光标记探针杂交,激光扫描提取数据,专用软件进行分析.结果 共得到2000份分型结果,用目前建库常用的分型试剂对4%随机抽样复核,符合率100%;进行基因频率统计分析,结果与以往资料报告接近.结论 HLA基因芯片是一项拥有中国自主知识产权的新技术,高通量、规范化、低价格是其显著优点,比较适合大规模集中化检测的实验室使用.
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江西地区1927例骨髓捐献人群HLA-A、B、DRB1的多态性探讨
目的：分析江西地区骨髓捐献人群人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)A、B、DRBl等位基因的多态性分布特征。方法应用流式-序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-SSO)与直接测序法(SBT)检测江西地区1927例骨髓捐献者的HLA-A、B、DRBl基因座位，采用Arlequin3．5软件计算HLA等位基因频率、单倍型频率和连锁不平衡参数等。结果低分辨状态下3个基因座分别检出17、29和12个等位基因，3个座位分布频率高的等位基因分别是HLA-A*02(0.3064)、HLA-B*40(0．1889)和HLA-DRBl*9(0．1917),常见的单倍型为HLA-A*02-B*46-DRBl*09(0．0721)。该人群HLA-A、B、DRBl等位基因在高分辨检测情况下分布不符合Hardy-Weinherg平衡(P＜0.05)。结论江西地区骨髓捐献人群HLA-A、B、DRBl等位基因和单倍型具有较高的遗传多态性。
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中国高尿酸血症患者HLA-B*58∶01基因的人群分布
目的 全面了解中国大陆各地区HLA-B* 58∶01基因的阳性率和频率,有效地指导高尿酸血症患者临床用药及临床基因筛查的必要性.方法 对中华骨髓库891 793例中国大陆人群行HLA高分辨分型,并按31个省市自治区分层,明确HLA-B* 58∶01基因阳性率和基因频率.结果 中国大陆人群HLA B*58∶01基因阳性率呈现南方人群中较其他地区高;按地区分类,华南地区的HLA-B* 58∶01基因阳性率高,西南地区及北方地区阳性率较低;按省市自治区分类,阳性率较高的分别为福建(28.43％)、广西(20.75％)、海南(20.20％)、广东(19.66％)、浙江(18.38％),阳性率较低的为天津(3.52％)、内蒙古(3.49％)、西藏(3.27％)、河北(3.11％)、山西(3.08％).结论 重视高尿酸血症HLA-B* 58∶01基因阳性人群,尤其应对中国南方人群高尿酸血症患者进行HLA-B*58∶01基因筛查,以避免使用别嘌呤醇所致严重不良后果.
关键词： 高尿酸血症 别嘌呤醇 HLA-B* 58∶01基因 中华骨髓库 -
DNA测序用于HLA常规分型方法难以确定样本的检测
由于中华骨髓库的建设推动了我国HLA分型检测技术的快速发展,从微量淋巴毒试验到SSP方法、到SSO杂交技术、再到基因芯片、DNA测序只经过了短短几年的时间[1-2].目前临床移植配型主要采用SSP方法,骨髓库建设则主要采用PCR-SSO荧光微珠流式杂交分型技术,该方法与SSP法相比,具有高通量、高分辨率、高可靠性等特点.但是由于现有的分型试剂均是以目前已经发现的基因序列为基础进行设计的,而且大多数是以西方人群资料为依据,在用来进行中国人群的HLA分型检测时不可避免的出现新的反应格局,有时无法与试剂盒所提供的判断模板相匹配,因而出现不确定的模棱两可结果.
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在中华骨髓库找到HLA匹配无关供者的概率
目的 计算在中华骨髓库(CMDP)找到HLA匹配无关供者的概率,探讨骨髓库佳库容量.方法 根据HLA表型频率计算找到HLA匹配供者概率.结果 在中华骨髓库248 978名HLA等位基因分型供者中,找到至少1例HLA-A,-B,-DRB1等位基因6/6匹配、HLA-A,-B,-C,-DRB1等位基因8/8匹配、HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DQB1等位基因10/10匹配供者的概率,分别为0.358 1、0.2749、和0.234 7.根据籍贯将供者分为北方和南方2大群体,在114 767名北方供者群体和114 767名南方供者群体中,找到至少1例6/6、8/8、10/10匹配供者的概率分别为0.2405和0.3383,0.1807和0.262 8,0.155 0和0.2225.结论 CMDP供者南北群体之间存在遗传学差异,北方供者HLA多态性高于南方供者.选择性增加特定籍贯供者,可提高该籍贯患者找到HLA匹配供者的概率.
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应用骨髓库HLA资料构建高匹配诱导多能干细胞库的可行性研究
目的 研究利用骨髓库HLA资料建立高匹配诱导多能干细胞(ipS)库的可行性.方法 通过对中华骨髓库湖南分库长沙实验室5236(人)份HLA分型数据统计分析,找出O型HLA-A、-B、-DRB1三座位纯合子数据,计算以纯合子志愿者为假定iPS供者、5236名随机志愿者为假定患者的匹配几率；同时计算随机志愿者HLA单体型频率,评估以O型HLA高频单体型纯合子志愿者为假设iPS供者的匹配几率.结果 在5236份骨髓供者资料中共发现O型HLA单体型纯合子14种,以此建库可以分别为49.81％ (2608/5236)、61.29％(3209/5236)、79.51％ (4163/5236)、75.76％ (3967/5236)及97.78％ (5120/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者；共检出17种高频率(HF＞1％)的单体型,以这些单体型的O型纯合子建库可以分别为64.06％ (3354/5236)、75.55％ (3 956/5 236)、81.11％ (4 247/5 236)、78.76％ (4124/5236)及98.28％ (5146/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者.结论 利用中华骨髓库现有的HLA资料可以建立数量少、效率高的iPS细胞库.
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吉林骨髓库汉族造血干细胞捐献者HLA-A、B、DRB1基因分布和单体型分析
目的 了解中国造血干细胞捐献者资料库吉林分库HLA基因及单体型分布特征.方法 采用PCR-SSP、PCR-SSO和PCR-SBT法对吉林分库内10 120份吉林籍汉族捐献者HLA-A、B、DRB1基因低分辨分型,用Excel软件计算HLA基因频率、单倍型频率及其连锁不平衡参数.结果 吉林分库内汉族捐献者的HLA-A、B、DRB1基因(含血清学特异性)分别有21、45、13种,频率高的基因是:A~*02、A~*24、A~*11、A~*30,B~*13、B~*60、B~*61、B~*62、B~*35、B~*46、B~*51,DR~*01、DR~*03、DR~*04、DR~*07、DR~*09、DR~*12、DR~*15.HLA单体型分布,两座位连锁频率较高的有:A30-B13、A02-B46、A02-B61、A02-B58,B13-DR07、B13-DR12、B46-DR09、B61-DR09,A2-DR09、A30-DR07、A02-DR12、A02-DR15;三座位连锁频率较高的是:A30-B13-DR07、A02-B46-DR09、A02-B13-DR12、A02-B61-DR09.结论 为临床造血干细胞移植寻找合适匹配的供受对,以及吉林地区汉族人群HLA基因多态性与HLA相关疾病的研究提供了有意义的参照数据.
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中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨单体型频率初步分析
目的 分析中华骨髓库造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 5位点在高分辨基因分型水平上的单体型频率及连锁不平衡特征.方法 根据718名中华骨髓库捐献者HLA 5位点高分辨分型数据,运用Arlequin 3.1 软件以大似然法分析单体型频率.结果 双座位连锁不平衡分析显示,HLA-C与HLA-B、HLA-DRB1与HLA-DQB1呈现较为显著的连锁不平衡;多位点单体型频率分析结果 显示,常见的2、3、4、5位点单体型分别为:A*0207-B*4601 (7.34%)、Cw*0102-B*4601 (8.71%)、B*1302-DRB1*0701 (6.19%)、DRB1*0901-DQB1*0303 (14.27%)、A*3001-B*1302-DRB1*0701 (5.36%)、A*0207-B*4601-Cw*0102(7.06%)、A*3001-Cw*0602-B*1302-DRB1*0701(5.36%)、Cw*0602-B*1302-DRB1*0701-DQB1*0202 (6.12%)、A*3001-Cw*0602-B*1302-DRB1*0701-DQB1*0202 (5.29%).结论 本研究提供了中华骨髓库718名捐献者HLA 5位点高分辨单体型频率遗传学数据,将为临床寻找HLA匹配的无关供者、法医学鉴定、HLA与疾病相关研究等提供分子遗传学参考.
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中华骨髓库HLA实验室工作流程表格化管理
中华骨髓库目前已有40万的库容,已经而且正在为救治急需移植的白血病患者提供机会.中华骨髓库的捐献者数据信息,由实验室传到各省分库再到国家管理中心(中华骨髓库国家总库),有一套计算机数据传输系统.
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PCR-SBT技术在山东骨髓分库HLA高分辨分型工作中的初步应用
目的 将基于测序分型(SBT)技术应用干中华骨髓库山东分库建设的探讨.方法 使用ABI 3730 xlDNA测序仪,采用SBT直接测序法,对山东地区的3 500份志愿者血液标本进行DNA测序,其中HLA Ⅰ类基因对第2、3和4外显子双向测序,Ⅱ类基因对第2外显子双向测序,以得到其HLA高分辨分型结果 ;对部分呈现中分辨分型结果 的标本,通过SSSP技术确认.结果 HLA-A、B、DRB1位点分别有48.23%、42.86%和76.91%得到高分辨结果.此3个位点均获得高分结果 的比例为15.91%.在随机增选的760例中分辨标本中,659例(86.71%)经SSSP技术后,获得高分辨结果.结论 SBT技术是骨髓分库开展HLA高分辨分型工作的有力工具.
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中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨等位基因频率分析
目的 分析中华骨髓库造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 5位点在高分辨基因分型水平上的等位基因频率特征. 方法 根据718名中华骨髓库捐献者HLA 5位点高分辨分型数据,运用直接计数法计算各位点基因频率.结果 在718名捐献志愿者中,共检出28个HLA-A等位基因、61个HLA-B等位基因、30个HLA-C等位基因、40个HLA-DRB1等位基因、18个HLA-DQB1等位基因;其中HLA-A位点常见等位基因为A·1101(21.66%)、A·2402 (16.37%)、A·0201 (13.79%);HLA-B位点常见等位基因为B·4001(11.49%)、B·4601(9.54%);HLA-C位点常见等位基因为Cw·0702 (15.74%)、Cw·0102(15.32%)、Cw·0304(11.56%);HLA-DRB1位点常见等位基因为DRB1·0901(14.69%)、DRB1·1501(12.40%)、DRB1·0701(9.89%);HLA-DQB1位点常见等位基因为DQB1·0301(20.54%)、DQB1·0303(15.81%)、DQB1·0601(10.79%).结论 本研究在高分辨基因分型水平提供了一套有关中国人群HLA-A,-B,-C,-DRB1和-DQB1 5位点基因频率数据.
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中华骨髓库云南分库HLA基因多态性分析
目的 了解中国造血干细胞捐献者资料库云南省分库HLA-A、B、DRB1基因多态性,及等位基因频率特征.方法 采用流武PCR-SSOP方法对来自中国造血干细胞捐献者资料库云南分库的1 000名无血缘关系的捐献者进行基因分型,运用直接计数法计算HLA-A、B、DRB1基因频率,并与其他人群进行比较.结果 在云南地区人群中共检出了68种HLA基因特异型.其中HLA-A位点18个,HLA-B位点37个,HLA-DR位点13个.A~*02(37.31%)、A~* 11(34.96%)和A~* 24(21.13%)3个等位基因为云南分库捐献者HLA-A座位的主要等位基因;B~* 46 (13.1%)、B~*15/62(11.8%)和B~* 40/60(9.7%)3个等位基因为云南分库捐献者HLA-B座位的主要等位基因;HLA-DRB1座位以DRB1~*12(20.06%)、DRB1~*04(14.44%)、DRB1~*09(13.51%)和DRB1~*15(13.11%)4个等位基因频率为高.结论 云南造血干细胞捐献者资料库人群的HLA基因多态性与南方汉族接近,也有其自身的一些特点.
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河南省造血干细胞资料库汉族捐献者HLA基因多态性调查
目的了解河南造血干细胞资料库捐献者人类白胞抗原HLA-A、B、DRB1等位基因多态性.方法按《中国造血干细胞捐献者资料库,组织配型实验室规程》(以下简称规程)的要求,采用国际通用的序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP),检测1626名造血干细胞捐献者的部分等位基因,计算各等位基因的频率,分析并与国内外不同地区汉族人群的调查结果对比.结果检出HLA-A等位基因17个,基因频率较高的有A2/0.2947、A11/0.1593、A24/0.1544、A33/0.1193;B位点共检出等位基因41个,高频基因为B13/0.1004、B51/0.0791、B46/0.0632、B40(60)/0.0741、B40(61)/0.0629、B35(0.0510)、B15/62(0.0694);DRB1高频基因为DR07/0.1377、DR04/0.1076、DR09/0.1270、DR12/0.1038、DR15/0.1715;未检出的等位基因有A36、A74、B4005、B15/70、B82.结论河南造血干细胞库汉族HLA基因多态性分布符合其种族、地区特点.
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基于Illumina Miseq测序技术的8000份标本HLA分型检测结果分析
目的 利用Illumina Miseq二代测序(NGS)技术进行HLA分型工作并分析其结果的准确性.方法 利用Illumina Miseq二代测序技术,对8 000人份血液标本进行HLA-A,HLA-B和HLA-DRB1位点的分型工作.为验证二代测序技术的准确性,同时选取1 000人份血液标本进行一代测序(PCR-SBT)分型实验,比较两种测序方法所得分型结果.结果 分型结果显示PCR-NGS HLA分型技术获得的数据与一代测序PCR-SBT技术数据完全吻合,且利用NGS测序技术的8 000人份标本中高分辨率结果7 908份(含G族1 058人份),中分辨率结果92份,高分辨率比例达到98.85％.结论 利用NGS测序技术进行HLA分型可以大大减少实验工作量,提高高分辨率结果比例,更容易对罕见型和新等位基因进行鉴定,在工作量大,时间紧迫时相对于传统的一代测序分型有明显优势.
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夯实管理基础 健康快速发展——中华骨髓库的管理和建设状况综述
中国造血干细胞捐献者资料库管理中心(以下简称中华骨髓库)始建于1992年3月,由于资金、技术和组织机构不到位,到2001年时入库总数据只有3万份血清学结果,基本处于停顿状态.直到2001年中国红十字总会重新启动了中华骨髓库的建设,中华骨髓库的管理和建设才迎来了转机.
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Luminex 3D平台在骨髓库供者HLA分型中的应用探讨
目的 探讨3D平台在中国造血干细胞捐献者资料库(简称中华骨髓库)入库分型中的应用.方法 基于3D仪器平台,使用试剂A对2014年中华骨髓库四川分库1 757份标本进行分型检测,使用Fusion3.4软件进行结果分析,依据中华骨髓库的入库标准指定结果,统计高分辨数据比例、中分辨模棱两可数据类型,并与四川分库2013年986份试剂B的分型结果和PCR-SBT方法的分型结果进行比较.结果 1 757例标本经试剂A分型后有3例为新等位基因,其余1 754例标本显示A、B、DR位点的高分数据百分比分别是98.5％ (n =1 728)、96.5％(n=1 695)、99.2％ (n=1 741),总的高分辨数据百分比95.l％(n =1 668),模棱两可结果A、B、DR位点分别有5种、18种、8种;986例经试剂B分型显示A、B、DR位点的高分数据百分比分别是99.1％(n=977)、74.9％(n=739)、99.0％(n=976),总的高分辨数据百分比73.5％(n=725),模棱两可结果A、B、DR位点分别有2种、83种、3种;1 177例PCR-SBT试剂结果显示A、B、DR位点的高分数据百分比分别是92.9％ (n =1 094)、95.9％ (n=1 129)、96.6％ (n=1 137),总的高分辨数据百分比86.8％(n=1 022),模棱两可结果A、B、DR位点分别有10种、16种、6种.结论 3D平台支持的SSOP技术操作和数据分析简便可行,其高分辨分型结果能够满足目前中华骨髓库供者HLA入库分型的要求.
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HLA实验室管理标准化建设和认可
为加强HLA(人类白细胞抗原)实验室管理标准化建设,我国部分HLA实验室依据国外认证认可准则建立了全面质量管理体系,有的HLA实验室通过了ISO/IEC 17025(《检测和校准实验室能力认可准则》)认可,有的通过了ASHI(美国组织相容性和免疫遗传学会)认证.实验室认可是权威机构对实验室有能力进行规定类型的检测和(或)校准所给予的1种正式承认;实验室认证则是第三方机构依据程序对产品、过程或服务符合规定的要求给予书面保证[1].
