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人白细胞抗原-DPB1基因直接测序分型技术
研究建立准确的基于人白细胞抗原-DPB1(HLA-DPB1)核酸序列的基因分型技术,为疾病与HLA基因相关性研究及器官、组织移植提供准确的HLA基因分型方法.使用第十一届国际组织相容性会议提供的引物,经PCR技术扩增、分离相应的基因片段,纯化后用PE公司四色荧光染料终止剂标记循环测序技术直接测定核酸序列,获得个体基因型序列资料,通过与基因型资料数据库比较确定基因型别.这一技术可以准确地确定个体的HLA-DPB1的基因型别并得到核酸序列.为进一步研究奠定了基础.本技术可用于其它类似的研究工作.
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基因组DNA高通量提取技术及其在骨髓库捐献者样本HLA基因分型中的应用
本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminex rS-SO HLA流式磁珠基因分型.使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA;提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用One lambda rSSO HLA-A、B和DRBI基因分型试荆盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度.结果表明:从400μ1全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3.217±0.715μg,A260/A280值平均为1.710±0.103,A260-A320/A280-A320值平均为1.761±0.151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本HLA-A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁殊的荧光信号强度均>600 RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度<50 RFU.结论:本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验.
关键词： 基因组DNA 基因组DNA高通量提取 中华骨髓库 HLA基因分型 -
改良盐酸胍法提取脐血DNA 用于HLA基因分型
为了比较经典的盐酸胍(Gu·HCl)抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法在提取脐血DNA的效果,探讨这两种方法在脐血组织相溶性抗原(HLA)基因分型中的应用,使用盐酸胍抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法提取72例脐血标本的DNA,并分别测定其DNA的浓度和纯度,采用序列特异性引物聚合酶反应方法(PCRSSP)比较这两种方法所提取的DNA.结果表明:两种方法提取脐血DNA均获成功;根据对DNA的质量监测发现,用改良盐酸胍抽提DNA在质量上较盐酸胍法好;用于HLA基因分型时,改良盐酸胍抽提DNA法可减少非特异性条带的出现.结论:改良盐酸胍抽提DNA法不但操作简便,成本下降,而且在少血量中能提取出高纯度的DNA,减少非特异性条带的出现.该法完全可以满足脐血库的日常脐血样品DNA的提取以及脐血HLA基因分型的要求.
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PCR-SSP法进行HLA分型的影响因素分析
目的:探讨DNA模板质量、DNA聚合酶(Taq)用量对人类白细胞抗原(HLA)分型结果的影响,从而确定PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)技术的更加优化的扩增体系.方法:采用PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,对山西地区14 400名骨髓供者的血样进行了人类白细胞抗原(HLA)基因分型,回顾性分析DNA模板的纯度、DNA用量、DNA聚合酶(Taq)酶用量对HLA分型结果的影响.结果:每个PCR反应的DNA模板量在30 ng～50 ng之间时PCR扩增效果优;每个PCR反应所用Taq酶为0.23 U时PCR扩增效果优.结论:DNA模板量和Taq酶用量是使用PCR-SSP技术进行HLA分型的主要影响因素;模板DNA的纯度对实验结果影响不大.
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山东骨髓库淄博地区志愿者HLA基因分布特征
目的 分析淄博地区的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A、B、DRB1位点等位基因频率,明确该地区HLA基因分布特征.方法 应用HLA基因分型技术进行HLA基因分型,应用直接计数法进行HLA基因频率分析.结果 得到一组较为准确的淄博地区HLA基因频率分布资料,初步明确淄博地区HLA基因分布特征,确定了淄博地区的常见HLA基因.结论 山东淄博地区HLA基因分布具有多态性,多数基因符合山东地区分布特点,少数基因分布具本地区特征.
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全自动加样设备抽提全血基因组DNA及其在HLA分型中的应用
目的 探索建立全自动加样设备抽提全血基因组DNA方法,并评估其在HLA分型中的应用情况.方法 利用Hamilton Microlab STATlet自动加样平台,选择相应的磁珠法试剂,并对加样、裂解、洗涤和洗脱参数进行优化.结果 自动抽提的全血基因组DNA 260 nm/280 nmA比值为1.7 ～1.9,浓度范围为40 ng/μl～ 100 ng/μl.3000例抽提标本的HLA测序分型可得到清晰的测序图谱,HLA-A、-B和-DRB1分型指定结果准确.结论 实验结果显示建立的全自动加样设备抽提全血基因组DNA方法是可行的.
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聚合酶链反应-反向杂交流式分析技术在骨髓库HLA基因分型中的应用
目的了解河南省汉族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性.评价流式反向SS0技术在骨髓库大量样本检测中的应用效果.方法用Luminex开发的反向SS0方法对2 200名造血干细胞捐献者进行HLA-A、B、DRB1基因分型,观察基因的分布情况,计算基因频率,并与不同地区不同种族人群进行比较.结果 HLA-A位点检出18个基因型别,基因频率较高的有A2、A11、A24、A33.HLA-B位点检出41个基因型别,基因频率较高的有B13、B51、B46、B40、B35、B15.HLA-DRBl位点检出13个基因型别,基因频率较高的有DRB107、DRB104、DRB109、DRB112、DRB105.结论我省汉族人群HLA基因呈高度的多态性,分布及基因频率与国外有非常显著的差异,与我国南方地区汉族有显著差异,与北方人群相近.LuminexSS0方法用于大量样本的HLA检测较PCR-SSP简便、节省人力、分辨率大大提高.
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应用PCR-SSOP技术进行大样本脐血HLA基因分型的探讨
目的:探讨一种高效、快速、准确、省力并能批量检测HLA基因分型的方法.方法:采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)反向杂交技术对天津地区汉族健康新生儿脐血HLA-A、B、DR位点进行中低分辨基因分型.结果:共检出72种HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗原,其中A位点抗原检出19种;B位点抗原检出40种;DR位点抗原检出13种.结论:PCR-SSOP是一种结果相对准确稳定、操作简便快速、适用于脐血库等进行大样本分型检测HLA多态性的分子生物学技术.
关键词： HLA抗原 HLA基因分型 脐血 聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针 -
改良离心吸附柱法提取全血DNA在HLA基因分型中的应用
目的:采用改良离心吸附柱法提取人类基因组DNA,能较快、地更好地适用于HLA高分辨基因分型.方法:170份EDTA2K2抗凝全血标本中90份标本采用改良离心吸附柱法、另外80份采用未改良离心吸附柱法提取DNA,用PCR-SSO方法做HLA-A、B、DR三个位点的基因高分辨分型.然后就所获DNA浓度和纯度、操作时间、分型结果4个方面进行统计学分析.结果:改良前后提取的DNA平均含量和纯度差异有统计学意义；整个操作时间改良后时间明显缩短；170份全血标本的DNA经扩增杂交后都能有较好的基因分型结果.结论:采用改良离心吸附柱法提取人类白细胞DNA,操作简单、快速省时、效率高.方法稳定、可靠,无一例失败,能缩短我们的DNA提取时间,有利于提高我们的工作效率,更好的适用于HLA基因分型.
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肇庆地区血小板供者库的建立及应用
目的 建立肇庆地区已知人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因分型及人类血小板抗原(human platelet alloantigen,HPA)HPA-1~6、9、15基因型的无偿机采血小板供者库,为临床血小板输注无效(platelet transfusion refractory,PTR)患者提供HLA及HPA相合的血小板.方法 采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(polymerase chain reaction-sequence specific olignuliotide probe,PCR-SSO)检测血小板供者的HLA基因分型及聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)检测HPA-1~6、9、15基因型.对杂合度高的HPA-3、15随机抽样20个标本进行测序.对3例患者进行HLA-I分型.结果 成功检测出101名无偿血小板捐献者HLA及HPA-1~6、9、15基因型;HPA-3、15的测序结果与PCR-SSP一致.HLA-A位点等位基因共检出11个;HLA-B位点共检出等位基因20个.3例患者中的1例从已知的HLA血小板库中找到完全一致供者,另外2例也找到三位点吻合的血小板供者.结论 建立基于HLA-I类抗原及HPA基因分型的血小板供者资料库,有助于给PTR患者提供HLA和HPA相合的单采血小板.
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斑秃患者HLA-A、B、DRB1基因多态性调查分析
目的 调查河南汉族斑秃患者HLA-A、B、DRB1中低分辨多态性分布,探讨该病与HLA的关联性.方法 收集2007年10月至2008年2月被河南省某医院皮肤科诊断为斑秃的121例河南籍汉族无血缘关系者血液标本,提取基冈组DNA,采用PCR-SSO流式荧光微珠法进行HLA-A、B、DRB1中低分辨检测,统计分析A、B、DRB1等位基因频率,并与本地区24 930份造血干细胞捐献者(对照组)进行对比,u检验分析两组样本间率的差异的显著性.结果 共检测斑秃患者血样121例,其中A位点等位基因频率较高的有A*02(0.2603)、A*11(0.1653)、A*24(0.1240),B位点等位基因频率较高的有B*15(0.2107)、B*13(0.1198)、B*40(0.1074),DRB1位点等位基因频率较高的有DRB1*15(0.2273)、DRB1*07(0.1364)、DRB1*09(0.1198)、DRB1*04(0.1074);在对照组中A位点等位基因频率较高的有A*02(0.2909)、A*11(0.1666)、A*24(0.1570),B位点基因频率较高的有B*15(0.1370)、B*13(0.1316)、B*40(0.1315)、B*51(0.0765),DRB1位点基因频率较高的有DRB1*15(0.1786)、DRB1*07(0.1322)、DRB1*09(0.1302)、DRB1*04(0.1082),两组样本A位点等位基因分布差异无统计学意义;斑秃患者DRB1*12频率低于正常对照组(P<0.05),B*15(62)和DRB1*15基因频率显著高于正常对照组(P<0.05).结论 斑秃患者与正常人群中HLA-A位点等位基因分布差异无统计学意义.DRB1*12可能对于斑秃的发病有抵御作用,B*15(62)和DRB1*15可能为斑秃的易感基因.
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2006-2014年中华骨髓库HLA基因分型抽检质量评价结果分析
目的 总结分析2006-2014年中华骨髓库志愿者HLA基因分型抽检质量评价结果,为提高中华骨髓库入库数据的HLA基因分型质量提供参考依据.方法 针对2％的随机抽检标本进行HLA基因分型复核,与入库时分型数据进行比对,统计分析各实验室HLA基因分型的错误率.结果 1)2006年1月-2014年11月,实际抽检来自全国31家HLA基因分型实验室的32 154份检测标本(2.0％);2) 2009-2014年抽检标本的中、高分辨基因分型数据比例逐年增加,从2012年,起高分辨基因分型数据占每年抽检标本总数的90％以上;3)2010-2014年抽检标本中5位点HLA基因分型数据入库比例逐年增加,2014年度HLA 5位点基因分型数据占全年抽检标本总数的50％以上;4)2006-2014年全部抽检标本基因分型总错误率评价结果显示,在2006年和2010年出现2次错误率高峰,2006-2009年低分辨分型数据的错误率由1.14％降至0.19％;2010-2014年中、高分辨基因分型数据的错误率由0.51％降至0.17％;5)2006-2014年,各HLA基因分型实验室的抽检标本基因分型平均错误率评价结果显示,有2家实验室连续错误率超标(＞2％).结论 HLA基因分型抽检数据质量评价项目对中华骨髓库志愿者HLA基因分型数据错误率的降低发挥了积极作用.
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无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法的建立
目的建立从无限增殖化人类B淋巴细胞提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量.方法用DNA提取试剂盒提取基因组DNA;用紫外分光光度法测定DNA样本的纯度和产量;用琼脂糖电泳法测定DNA样本的完整性.结果 (1～2)×107个B淋巴细胞提取基因组DNA的平均浓度为174±61.3 ng/μl,DNA的纯度平均为1.73±0.047(A260nm/A280nm),琼脂糖电泳测得DNA分子量约为21 kb,且无污染.结论该方法可以从无限增殖化人类B淋巴细胞提取高质量高浓度的基因组DNA.
关键词： 基因组DNA 无限增殖化人类B淋巴细胞 HLA基因分型
