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5'-杂氮-2'-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究
本研究探讨5'-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞体外作用的机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)转位及细胞凋亡;用RT-PCR检测p15INK4B基因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测p15INK4B基因甲基化程度.结果表明:5-Aza-CdR对MUTZ-1细胞有生长抑制作用;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变.p15INK4B基因甲基化程度随5-Aza-CdR剂量增加而减弱,伴随p15INK4B基因mRNA表达增加.经3.2mmol/L 5-Aza-CdR作用48小时后,MUTZ-1细胞DNMT3AmRNA表达水平较未加药组明显下降(灰度比为0.385:0.654,P＜0.05),DNMT1、DNMT3BmRNA表达水平与未药组相比无明显改变.结论:在0.4-6.4 mmol/L浓度范围5-Aza-CdR通过诱导MUTZ-1细胞凋亡而抑制该细胞生长,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一.5-Aza-CdR可能通过下调DNMT3AmRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,从而恢复其表达.
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三氧化二砷诱导MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控研究
为了研究三氧化二砷(AS2O3)诱导人类骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型(MDS-RAEB)细胞株MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控机制,采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性;RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)、TRF1(TTAGGG repeat binding factor 1)、TRF2(TFAGGG repeat binding factor 2)、bcl-2、bax等基因mRNA水平的表达;磷脂酰丝氨酸(PS)转位等方法检测细胞凋亡.结果表明:1-8μmol/L AS2O3诱导MUTZ-1细胞凋亡呈时间、浓度依赖关系.在该浓度范围内,As2O3可下调细胞端粒酶活性,且端粒酶活性下调与凋亡细胞阳性率呈明显负相关(r=-0.938,P=0.018).MUTZ-1细胞经As2O3作用后,hTERT基因mRNA表达下调,并与端粒酶活性变化呈正相关(r=0.783,P=0.022),但As2O3对TRF1及TRF2基因mRNA表达没有明显影响.MUTZ-1细胞端粒酶活性受抑制同时,伴有bcl-2 mRNA表达下调及bcl-2/bax比值下降.结论:AS2O3可能通过抑制细胞端粒酶活性及hTERT表达,诱导MUTZ-1细胞凋亡.As2O3抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性可能是诱导该凋亡机制之一.
关键词： As2O3 MUTZ-1细胞 细胞凋亡 端粒酶 骨髓增生异常综合征-难治性贫血 -
M-FISH用于骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1复杂核型的检测分析
本研究的目的是观察伴有5号染色体缺失的MDS细胞株MUTZ-1细胞的遗传学变化.首先采用R显带技术对染色体标本进行核型分析,再以vysis Spectra VysionTMM-FISH作为探针,检测并分析其复杂异常核型.结果表明:M-FISH分析显示有明显的高频率染色体的易位、插入、断裂与重接、缺失、数目增多;染色体分析揭示核型为50,xx,der(1)t(1;2),ins(1;14),+der(2)t(2;19),der(3)t(3;5),der(3)(3::5::22),5q-,der(6)t(3;6),der (7)(18::7::17),+8,+der(9)t(1;9),der(10)t(1;10),+11,+12,der(?13)(10::13::5::8),der(14)t(8;14),der(14)t(14,15),der(15)t(15;21)×2,+17,+18,-21,-22.结论:MDS细胞株MUTZ-1在M-FISH检测下有显著复杂的核型变化;M-FISH能增加高度复杂的异常染色体检测的准确性,有助于MDS的诊断和预后评估.
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雷帕霉素诱导骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞凋亡及机制研究
为了观察雷帕霉素(RAPA)对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞系MUTZ-1增殖的抑制、凋亡作用并探讨其相关的机制.用MTT法检测RAPA对MUTZ-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析MUTZ-1细胞Annexin V/PI、caspase 3、细胞周期、PTEN、P-Akt和p-mTOR蛋白的表达.结果表明,RAPA能显著抑制MUTZ-1细胞增殖,呈剂量和时间的量效关系(24、48和72小时的r=0.67,0.61和0.72).RAPA作用MUTZ-1细胞24-72小时,G0/G1期细胞较对照组明显增高(p<0.01),随着药物浓度增加而增多(r=0.94、0.93和0.92),细胞周期阻滞在G0/G1期.Annexin V+PI-细胞较对照组增多(p<0.01),且随着浓度的增高而增多(r=0.91、0.94和0.96).PTEN表达荧光强度与对照组比较显著增高(p<0.01),随着药物浓度增高表达增强(r=0.93),p-Akt和p-mTOR表达的荧光强度与时照组比较显著降低(p<0.05),随着药物浓度增高而表达减低(r=0.95和0.91).结论:RAPA与靶分子mTOR作用,抑制PTEN/P13K-Akt/mTOR信号转导通路,诱导MUTZ-1细胞凋亡.
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2-甲氧基雌二醇诱导MUTZ-1细胞凋亡及对端粒酶活性的影响
目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)诱导骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株MUTZ-1细胞凋亡及其对细胞端粒酶活性表达的影响,以及细胞凋亡和端粒酶活性之间的相关性.方法 采用不同浓度的2-ME处理MUTZ-1细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的改变;用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性变化.结果 1、2和4 μmol/L 2-ME分别作用MUTZ-1细胞12 h,流式细胞术检测出G0/G1期和S期细胞逐渐减少,G2/M期细胞明显增多(P＜0.05),细胞被阻滞于G2/M期;1和2 μmol/L 2-ME作用MUTZ-1细胞12 h,两组凋亡率均无明显增加(P＞0.05);1、2和4μmol/L 2-ME作用MUTZ-1细胞36 h时,凋亡率为(12.87±0.86)%～(21.82±1.71)%,2-ME诱导细胞凋亡具有时间和剂量依赖性;2-ME诱导MUTZ-1细胞凋亡的同时伴随着端粒酶活性下调,且随着2-ME浓度增加和作用时间延长,端粒酶活性抑制作用增强;端粒酶活性下调与G2/M期细胞数呈负相关(r=-0.979,P=0.021),与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.970,P=0.030).结论 2-ME诱导MUTZ-1细胞凋亡并抑制其端粒酶活性可能是其抗肿瘤的机制之一.
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Bid蛋白在内质网和线粒体相关的凋亡过程中的作用
目的 研究Bid蛋白在内质网和线粒体相关的凋亡过程中的作用.方法 以高三尖杉酯碱(HHT)诱导人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞系MUTZ-1细胞凋亡,用流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法检测线粒体和内质网凋亡途径的相关基因及蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察用药前后钙离子浓度和线粒体膜电位的改变以及凋亡相关蛋白Bid的转位.结果 0.05μg/ml HHT作用后4 h胞质内Ca2+浓度增高,12 h达高峰,其后开始下降.HHT作用后线粒体膜电位持续下降.内质网应激相关因子基因及蛋白表达增强,12 h达到高峰,其后开始下降.激光共聚焦显微镜观察发现Bid蛋白用药前位于内质网,用药12 h后转位至线粒体.结论 HHT可以诱导MDS细胞凋亡,内质网和线粒体相关的凋亡途径在其中发挥了重要的作用,Bid蛋白可能是两种凋亡途径的交叉点.
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二硫化二砷和靛玉红对骨髓增生异常综合征细胞MUTZ-1凋亡及其相关蛋白的影响
目的 研究中药青黄散主要成分二硫化二砷(As2S2)和靛玉红对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株MUTZ-1细胞周期、凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的影响.方法 实验于2015年6月-2016年6月在中国中医科学院西苑医院血液科实验室进行.以MDS-RAEB细胞株MUTZ-1为研究对象,实验分4组:对照组、As2S2组、靛玉红组和联合组(As2S2和靛玉红联合应用).以As2S2、靛玉红及二者联合分别作用MUTZ-1细胞48 h和72 h,以流式细胞术检测细胞周期,以Annexin V-FITC/PI法检测细胞的凋亡情况,以流式细胞术检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达.结果 As2S2和靛玉红对MUTZ-1细胞有明显的抑制作用.与对照组相比,As2S2组和联合组在48 h时S期和G2/M期细胞的比例减少、G0/1期细胞比例增加(P均＜0.05);在72 h时S期细胞的比例减少、G0/1期细胞比例增加(P均＜0.01),G2/M期细胞的比例无明显变化(P=0.842).与对照组比较,靛玉红组细胞不同时间点各细胞周期无明显变化(P均＞0.05).与As2 S2组和靛玉红组相比,联合组在48 h时S期和G2/M期细胞比例减少,G0/1期细胞比例增加(P均＜0.01);72 h时S期细胞比例减少,G0/1期比例增加(P＜0.01).与对照组相比,As2S2组和靛玉红组细胞早期凋亡明显增加(P＜0.05).与As2S2组和靛玉红组相比,联合组促进早期凋亡作用也增强(P＜0.05).与对照组比较,靛玉红组和联合组在48 h时细胞表达Caspase-3增加(P＜0.01);As2S2组在72 h时细胞表达Bcl-2减少(P＜0.01)、Bax增加(P＜0.05).与As2S2、靛玉红组相比,联合组对MUTZ-1细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的无影响(P＞0.05).结论 中药青黄散主要成分As2S2和靛玉红通过促进MDS细胞MUTZ-1的凋亡、影响凋亡相关蛋白起到治疗MDS的作用,单用As2S2可抑制MUTZ-1细胞的增殖,与靛玉红联合应用能增强其调控细胞周期、促进细胞凋亡的作用.
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尿多酸肽对高危组骨髓增生异常综合征细胞株p15INK4B基因的去甲基化作用
目的 探讨尿多酸肽(CDA-2)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株p15INK4B基因的去甲基化作用.方法 检测不同浓度CDA-2作用下,MDS-RAEB细胞株MuTz-1的细胞存活率(MTT法):p15INK4B因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达(RT-PCR);p15IN4B基因甲基化程度(甲基化特异PCR,MSP).结果 CDA-2呈剂量依赖性抑制MuTz-1细胞生长;伴随CDA-2剂量增加.p15IN4B基因甲基化程度逐渐减弱,其mRNA表达逐渐增加;且CDA-2可显著降低MuTz-1细胞中DNMT1和DNMT3B mRNA的表达.结论 CDA-2可能通过下调DNMT1和DNMT3B mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,恢复其在细胞周期中的调节作用,进而抑制MDS细胞的过度增殖.
关键词： 尿多酸肽 骨髓增生异常综合征 MUTZ-1细胞 p15INK4B基因 -
2-甲氧基雌二醇对MUTZ-1细胞内活性氧和线粒体膜电位的影响
目的 探讨在2-甲氧基雌二醇(2-ME)诱导骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)MUTZ-1细胞凋亡中活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ψm)的作用及其作用机制.方法 MUTZ-1细胞与不同浓度2-ME共育,FCM分析荧光探针DCFH-DA标记后细胞内ROS和荧光探针JC-1标记后细胞△ψm的变化.加入抗氧化剂过氧化氢酶(CAT)后,MUTZ-1细胞内相应指标的变化.结果 经1～4μmoL/L 2-ME作用MUTZ-1细胞12 h,与对照组相比,细胞内ROS升高(F=102.56,P<0.05)和细胞△ψm下调(F=108.02,P<0.05),且MUTZ-1细胞△ψm下降与细胞内ROS升高成正相关(r=0.981,P=0.019).CAT能够明显抑制2-ME诱导MUTZ-1细胞内ROS升高(F=68.26,P<0.01)和细胞△ψm下调(F=55.29,P<0.01).结论 2-ME诱导MUTZ-1细胞凋亡,可能与2-ME刺激细胞内ROS积聚过多、损伤线粒体结构的完整性以及降低细胞线粒体膜电位有关.
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三氧化二砷对人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1细胞的作用
目的:研究三氧化二砷(AS2O3)在体外对人骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型(MDS-RAEB)细胞株MUTZ-1细胞增殖的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:采用细胞形态学、MTT法、DNA凝胶电泳、RT-PCR、诱导分化检测、流式细胞术等多参数分析.结果:①低浓度AS2O3(0.05～0.25 μmol/L)对MUTZ-1细胞无明显生长抑制作用,细胞培养2周后,细胞阳性表面抗原CD38、CD7、CD10、HLA-DR表达明显下降(P<0.05),粒系分化抗原CD11b无明显表达增多(P>0.05).②AS2O3 1.0～20.0 μmol/L对MUTZ-1细胞有凋亡作用,且呈浓度依赖(r=-0.999,P<0.05).bcl-2 mRNA随AS2O3浓度增加表达明显下调(P<0.05),bcl-2/bax比例明显下降(P<0.05).结论:0.05～0.25 μmol/L AS2O3对MUTZ-1细胞可能具有部分分化作用;1.0～20.0 μmol/L AS2O3主要通过诱导凋亡使MUTZ-1细胞死亡.
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磷酸氟达拉滨对MUTZ-1细胞作用及机制研究
目的:在体外研究磷酸氟达拉滨(fludarabine)对人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1细胞的作用以及可能的作用机制.方法:采用MTT法、透射电境、DNA凝胶电泳、流式细胞仪以及RT-PCR等分析方法.结果:磷酸氟达拉滨能抑制MUTZ-1细胞的生长,24、48、72 h的IC50分别为137.65 mg/L、6.27 mg/L、0.51 mg/L,具有浓度和时间依赖性.经透射电境、DNA凝胶电泳和Annexin V/PI检测,证实1～16 mg/L磷酸氟达拉滨对MUTZ-1细胞作用24 h后,可以诱导MUTZ-1细胞凋亡,其对Bcl-2、Bax、survivin、XIAP、cIAP1和cIAP2基因mRNA表达均无明显下调作用,但可以导致MUTZ-1细胞线粒体膜电位的下降.结论:1 mg/L～16 mg/L磷酸氟达拉滨不但能抑制MUTZ-1细胞生长而且能诱导细胞凋亡,诱导细胞凋亡是其主要细胞毒作用之一.线粒体膜电位下降是其诱导细胞凋亡的重要环节之一.
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二乙酰己二胺诱导骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞凋亡及其机制研究
目的 体外研究二乙酰己二胺(CAHB)对人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株MUTZ-1细胞的作用以及可能的作用机制.方法 用CAHB处理MUTZ-1细胞,光学显微镜下观察不同浓度的CAHB处理后MUTZ-1细胞形态的改变;利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测CAHB对MUTZ-1细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布变化;利用RT-PCR技术检测凋亡相关基因survivin、Bcl-2的表达变化.结果 CAHB能抑制MUTZ-1细胞的生长,具有浓度和时间依赖性;随着CAHB药物浓度的增加MUTZ-1细胞出现凋亡细胞的典型形态学特征改变;CAHB作用后,MUTZ-1细胞的DNA含量在细胞周期的分布有明显变化,G0/G1期细胞比例无明显变化,S期细胞减少,而G2/M期细胞增多,细胞被阻滞在G2期,呈浓度依赖;在细胞凋亡过程中抗凋亡基因Bcl-2、SurvMn基因下调.结论 CAHB不但能抑制MUTZ-1细胞生长而且能诱导细胞凋亡,诱导细胞凋亡是其主要细胞毒作用之一.抗凋亡基因Bcl-2、Survivin基因下调可能是其诱导细胞凋亡的机制之一.
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拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康对MUTZ-1细胞系作用的研究
目的:研究拓扑替康(TPT)对骨髓增生异常综合征(MDS)急性髓系白血病(AML) M2变细胞系MUTZ-1的作用机制,以及环磷酰胺(CTX)对TPT作用靶标Topo-Ⅰ mRNA表达水平的影响.方法:MTT法测定TPT对MUTZ-1细胞的杀伤作用.流式细胞术分析TPT对MUTZ-1细胞周期的影响.染色体分析方法观察TPT对MUTZ-1的影响.半定量RT-PCR检测CTX对Topo-Ⅰ mRNA表达水平的影响.结果:①5、10、20、40、80、160 nmol/L TPT与MUTZ-1细胞共培养72 h后细胞存活率呈剂量依赖性性下降,分别为(78.9±10.7)％、(69.2±4.7)％、(58.6±7.1)％、(49.9±7.6)％、(42.4±0.8)％和(23.7±9.8)％,各实验组与对照组(505.6±20.1)％之间均差异有统计学意义(均P＜0.05).②TPT阻碍MUTZ-1细胞染色体发生分离,并使MUTZ-1细胞发生G2/M期阻滞,该阻滞呈时间依赖性和剂量依赖性.③半定量RT-PCR发现0.224 mmol/LCTX与MUTz-1细胞共培养24、48和72 h后,Topo- Ⅰ mRNA表达都上升,以48 h的表达量高.结论:TPT对MUTZ-1细胞的生长抑制呈剂量依赖性.染色体分离受阻和G2/M期阻滞是TPT的作用机制之一.CTX可上调Topo-Ⅰ表达,与TPT发挥联合抗白血病作用.
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三氧化二砷、沙利度胺对人类骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1体外生长的影响
目的 探讨沙利度胺和三氧化二砷对人类骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1的影响及其作用机制.方法 采用CCK-8法检测三氧化二砷、沙利度胺以及二者联合用药对MUTZ-1细胞株增生是否有抑制作用.采用半定量RT-PCR方法分别检测三氧化二砷、沙利度胺以及二者联合对MUTZ-1的Bmi-1基因是否有抑制作用,并用流式细胞术对细胞株行凋亡检测.结果 沙利度胺体外对MUTZ-1细胞无明显生长抑制作用(P＞0.05),三氧化二砷对MUTZ-1细胞有明显生长抑制作用(P＜0.05),联合用药组的抑制作用明显高于三氧化二砷、沙利度胺单独用药组(CDI＜0.7);三氧化二砷组的细胞凋亡率随着药物浓度增加而升高,呈剂量依赖(r=0.627,P＜0.05);沙利度胺组细胞凋亡率随着药物浓度增加无明显升高(r=0.313,P＞0.05),联合用药组随着药物浓度增加表达亦升高(P＜0.05);三氧化二砷组Bmi-1/β-actin随着药物浓度增加表达下降,呈剂量依赖性(r=-0.912,P＜0.05),沙利度胺组Bmi-1/β-actin随着药物浓度增加表达无明显下降(r=0.594,P＞0.05),联合用药组对Bmi-1的抑制作用明显高于三氧化二砷、沙利度胺单独用药组(CDI＜0.7).结论 沙利度胺体外对MUTZ-1细胞无明显生长抑制作用,三氧化二砷对MUTZ-1细胞有明显生长抑制作用,联合用药组的抑制作用明显提高.
