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二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响
目的研究二氢叶酸还原酶(DHFR,D)与谷氨酰胺合成酶(GS,G)单基因和二氢叶酸还原酶与谷氨酰胺合成酶(DHFR+GS,DG)双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响.方法选择N端部分TPO基因(T184)作为靶基因,以DHFR和GS基因作为筛选及扩增基因构建重组质粒pDCT184与pGCT184,将两种质粒分别转染CHO dhfr-细胞形成单基因筛选扩增系统,两种质粒共转染CHO dhfr-细胞形成双基因筛选扩增系统.在双基因筛选扩增系统中设计三种药物加压方式.第一种为DG方式:先用DHFR系统压力(MTX)筛选,再用GS系统压力(MSX)筛选;第二种为GD方式:先用GS系统压力筛选(MSX),再用DHFR系统压力筛选(MTX);第三种为共加压方式:同时利用DHFR与GS系统压力筛选(MTX+MSX).通过比较T184基因拷贝数及表达水平来研究DHFR和GS双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响.结果 T184基因拷贝数及表达水平在DG双基因筛选扩增系统不同药物加压方式中,均比DHFR或GS单基因筛选扩增系统高,但不同药物选择方式没有明显差异.结论采用DHFR+GS双基因筛选扩增系统共加压方式是提高CHO dhfr-细胞表达外源基因的有效途径.
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亲和毛细管电泳法测定甲氨蝶呤对映体与二氢叶酸还原酶反应动力学参数
目的 建立一种测定氨甲蝶呤(MTX)两种对映体与二氢叶酸还原酶(DHFR)结合反应动力学参数的方法.方法 建立DHFR反应体系,采取亲和毛细管电泳技术,以含0.2%Brij-35的pH 9.50的50mmol/L硼砂为电泳缓冲液,检测波长为254 nm,在25 kV的电压下,分离反应体系中各组分.观察酶反应前后的电泳图谱并根据反应生成物峰面积的变化计算相关反应动力学参数,将不同浓度的氨甲蝶呤两种对映体L-(+)-MTX和D-(-)-MTX分别作用于所建立的DHFR反应体系,测定两种对映体的半数抑制浓度(IC50).结果 建立了亲和毛细管电泳法对氨甲蝶呤对映体与DHFR反应动力学参数的测定方法,在30 min内实现DHFR反应体系中反应物和生成物的分离,并根据反应生成物峰面积的变化计算得出D-(-)-MTX的IC50为3.17×10-7mol/L,L-(+)-MTX的IC50为2.48×10-8mol/L,两者相差13倍左右.结论 亲和毛细管电泳的方法可以快速准确地用于DHFR反应动力学参数的研究,通过检测MTX对映体对DHFR的抑制能力的差异,首次发现MTX对映体对DHFR有立体选择性作用.
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动脉粥样硬化性脑梗死的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性研究
目的 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系.方法 采用聚合酶链式反应和限制片断长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测62例动脉粥样硬化性脑梗死患者和79名健康对照者的C677T突变的基因型.结果 MTHFR基因C677T突变型等位基因(V)频率在患者组和对照组间比较,差异有显著性意义(x2=4.41,P＜0.05);3种基因型频率在两组人群中差异均无显著性意义.基因型频率的相对危险分析,AV基因型比AA基因型患脑梗死的危险高1.76倍;VV基因型比AA基因型患脑梗死的危险高3.25倍.结论 MTHFR基因C677T突变型等位基因与动脉粥样硬化性脑梗死有一定的关联,突变基因型增加了动脉粥样硬化性脑梗死的发病危险.
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风湿性疾病中高同型半胱氨酸血症的临床研究
目的分析多种风湿性疾病患者血浆中同型半胱氨酸(Hcy)水平及其相关因素.方法 测定54例系统性红斑狼疮(SLE)、48例类风湿关节炎(RA)、60例强直性脊柱炎(AS)、30例未分化脊柱关节病(uSpA)患者和62例正常对照的Hcy、VitB12、叶酸的水平和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因677位的多态性.结果 (1)各疾病组Hcy水平分别为:SLE组(19.04±6.86)μmol/L,RA组(19.07±7.43)μmol/L,AS组(16.47±6.50)μmol/L,uSpA组(16.59±6.72)μmol/L,对照组(12.24±3.58)μmol/L,各疾病组Hcy水平明显较对照组高,其差异有统计学意义(P<0.01);(2)Hcy与VitB12、叶酸呈负相关,相关系数分别为-0.701和-0.443,P<0.01;(3)MTHFR基因677位C→T的突变使Hcy水平升高, CC型(13.41±5.78)μmol/L,CT型(16.81±4.22)μmol/L,TT型(20.88±6.60)μmol/L,P<0.01;TT基因型是高Hcy血症的易感基因(OR=84.46,P<0.05);TT基因型还是SLE的易感基因(OR=7.56,P<0.05).结论 (1)SLE、RA、AS、uSpA 4种疾病患者普遍存在高Hcy血症.(2) 导致高Hcy血症的原因可能有叶酸、VitB12的水平降低和MTHFR基因的突变.(3)TT型基因是Hcy异常升高的易感基因,也是SLE的易感基因.
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转染甲氨蝶呤阿糖胞苷双耐药基因的小鼠骨髓细胞对大剂量化学治疗的保护作用
目的探讨同时导入人双突变的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和胞苷脱氨基酶基因(CD)小鼠骨髓细胞对大剂量甲氨蝶呤(MTX)和阿糖胞苷(Ara-C)的耐受性及骨髓耐受联合化疗的可行性.方法以反转录病毒为载体,将人双突变的DHFR和CD通过共培养转染入两只小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞经Ara-C、MTX、Ara-C+MTX处理后,耐MTX及Ara-C粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)生成情况;转基因小鼠骨髓细胞提取的DNA,用聚合酶链反应(PCR)检测转基因小鼠骨髓细胞耐药基因的表达.结果含有耐药基因(SFG-F/S-CD)的骨髓细胞均有耐药克隆的形成,耐Ara-C、MTX、Ara-C + MTX克隆分别为56%、22%和14%,并明显增加了对MTX和Ara-C的耐受(P<0.005);转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有F/S、CD基因表达;耐药基因转染后小鼠骨髓细胞对MTX和Ara-C 的耐受明显增加.结论双耐药基因可以导入小鼠骨髓细胞并且获得表达,提高了造血细胞对MTX和Aar-C的耐药性.
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双突变二氢叶酸还原酶基因对小鼠骨髓细胞化疗保护作用的体外研究
目的:探讨将人双突变的二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase,DHFR)导入小鼠骨髓细胞中,观察小鼠骨髓细胞对大剂量甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)的耐受性,研究骨髓耐受大剂量化疗的可行性.方法:以反转录病毒为载体,将DHFR通过共培养转染入小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞耐MTX CFU-GM生成情况;小鼠骨髓细胞提取的DNA,用PCR检测小鼠骨髓细胞耐药基因的表达.结果:含有耐药基因(SFG-F/S)的骨髓细胞耐药克隆为16%,对照组为0, χ2=47.88, P<0.005;转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有F/S基因条带;耐药基因转染后小鼠骨髓细胞对MTX 的耐受明显增加.结论:耐药基因可以进入小鼠骨髓细胞并且获得共表达,提高了造血细胞对MTX的耐药性.
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MTHFR基因C677T多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究
目的:探讨MTHFR基因C677T多态性与非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCI/P)相关性.方法:收集97个核心家庭和104个对照家庭,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法,进行MTHFR基因C677T位点多态性检测;用人群关联研究、传递不平衡检验(transmission-disequlibrium test,TDT)、单倍型相对风险率(haplotype-based haplotype relative risk,HHRR)、家系为基础的关联检验(family-based association test,FBAT)等进行统计分析.结果:人群关联研究分析表明,子代、父亲、母亲的病例组和对照组之间基因型和等位基因的分布差异无统计学意义(P>0.05);子代、父亲、母亲组,CT基因型携带者相对于CC基因型携带者的OR分别为1.02(95%CI 0.47～2.21)、0.62(95%CI 0.29～1.32)、0.66(95%CI 0.31～1.40);TT基因型携带者相对于CC基因型携带者的OR分别为1.10(95%CI 0.44～2.74)、0.95(95%CI 0.39～2.32)、0.68(95%C/0.28～1.66);T相对于C基因的OR分别为1.07(95%CI 0.72～1.58)、0.98(95%CI 0.66～1.46)、0.83(95%C/0.56～1.24).携带有突变基因T并不能增加患NSCL/P的危险.病例组核心家庭分析表明,TDT检验X2=1.817,P>0.05;HHRR检验X2=1.76,P>0.05;FBAT检验Z=1.348,P>0.05.结论:没有发现MTHFR C677T多态性和NSCLP无关联性,该基因位点的变异可能不会导致中国东北地区人群NSCLP的发生.
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老年PAOD同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变频率的研究
目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、胱硫醚β合成酶(CBS)基因844ins68、甲硫氨基合成酶(MS)基因A2756G三种同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关酶基因突变在北京社区汉族老年周围动脉闭塞性疾病(PAOD)发病中的意义.方法:PCR扩增老年PAOD 83 例及 100 例老年健康对照的MTHFR、CBS、MS基因突变点,直接或经限制性内切酶消化后行凝胶电泳确定基因型. 结果:老年PAOD病例组MTHFR基因中,T/T基因型占34.9%,明显高于老年健康对照组的19%(P<0.01);C/C占13.3%,明显低于老年健康对照组的31%(P<0.01);C/T与老年健康对照组无明显差异(P>0.05).老年PAOD病例组MTHFR等位基因T突变位点的频率占60.8%,明显高于老年健康对照组的44%(P<0.01).CBS 844ins68、MS A2756G各种基因型频率和等位基因频率在老年PAOD病例组和老年健康对照组之间无差异. 结论:在北京社区汉族老年人群中,MTHFR等位基因C677T突变可能是老年PAOD独立的遗传性危险因子,而CBS基因844ins68、MS基因A2756G的突变可能不足以成为遗传危险性.
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亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与宫颈癌的关系
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发生是环境致癌因素与遗传因素共同作用的结果.目前研究表明,亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与宫颈癌的发生密切相关,其降低了叶酸代谢酶的活性,影响细胞内正常DNA的合成及甲基化,以及通过与环境因素例如叶酸水平、人乳头瘤病毒(HPV)感染、饮酒、吸烟及原癌基因的交互作用,从而改变个体对宫颈癌的易感性,并且在不同国家、不同种族分布存在显著差异.同时,MTHFR基因多态性表达与肿瘤预后有关,可能改变化疗的敏感度和化疗药物的毒性,但其与宫颈癌预后的关系尚未明确.现就MTHFR基因多态性与宫颈癌的易感性、流行病学调查及预后评估等方面的关系进行综述.
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MTHFR基因多态性与冠心病的关系
目的:研究天津地区人群N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C 677 T多态性与冠心病的关系.方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析技术检测50例冠心病患者(冠心病组)和50例正常人(对照组)MTHFR基因C 677 T多态性,应用高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平,采用125Ⅰ标记放免法测定血清叶酸浓度.结果:(1)冠心病组与对照组MTHFR基因频率分布不同(P＜0 05),对照组CC型、TC型、TT型基因频率分别为52.0%,28.0%,20.0%;冠心病组分别为26.0%,44.0%,30.0%.冠心病组T等位基因频率为52.0%,C等位基因频率为48.0%,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05).(2)两组的TT基因型者血浆Hcy浓度均明显高于CC和TC基因型者(P＜0.05),而后两者间无显著性差异(P＞0.05).(3)冠心病组Hcy浓度高于对照组(P＜0.05).两组叶酸水平无显著性差异(P＞0.05),血浆Hcy浓度与叶酸水平均呈显著负相关(r分别为-0.617和-0.588,P＜0.05).结论:MTHFR基因C 677 T点突变与冠心病发病密切相关,MTHFR基因纯合突变是引起高Hcy血症的一个重要的遗传因素.
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双向电泳分析CCR5对二氢叶酸还原酶表达的抑制作用
目的:采用双向电泳为基础的蛋白质组学的研究手段,发现趋化因子受体5被配体激活后的功能相关蛋白质.方法:构建稳定表达CCR5的HEK-293细胞株.用RANTES刺激12 h后,用双向电泳方法进行分析.在以PDQuest图像分析软件进行分析后,对表达有差异的蛋白质进行MOLDI-TOF MS/MS质谱鉴定,并对鉴定的蛋白作RT-PCR初步分析.结果:流式细胞仪检测结果表明HEK-293细胞稳定表达CCR5,在受RANTES刺激后作双向电泳分析并经质谱鉴定后,发现二氢叶酸还原酶表达降低,与RT-PCR检测结果相一致.结论:经蛋白质学组方法分析,发现CCR5被其配体RANTES激活后抑制了二氢叶酸还原酶的表达.
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血浆Hcy及其代谢酶基因多态性与Alzheimer病的关系
目的探讨血浆同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)及其相关代谢酶N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的关系. 方法对104例AD患者、100例健康对照组运用高压毛细管电泳紫外检测法测定血浆Hcy水平,采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法检测MTHFR基因第4外显子C677T、CBS基因第8外显子844ins68的多态性. 结果 AD患者血浆Hcy(16.18±3.35) μmol/L非常显著高于健康对照者Hcy(12.24±3.96) μmol/L.AD组和对照组受试者间MTHFR C677T和CBS基因844ins68的各基因型分布和等位基因频率均无显著性差异,仅MTHFR的T等位基因与受试者血浆Hcy水平升高有关. 结论 AD患者的血浆Hcy水平高于健康人群,可能与疾病的发生发展有关;并可能主要由环境因素所致,而非MTHFR和CBS基因变异引起.补充VitB12和叶酸有助于AD的治疗.
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耶氏肺孢子菌对磺胺类药物耐药相关基因突变的研究进展
肺孢子菌肺炎是由耶氏肺孢子菌引起的,发生在免疫功能低下人群中的机会性感染.大量证据表明,耶氏肺孢子菌对磺胺类药物耐药性增加与二氢叶酸合成酶(DHPS)基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因突变有关,但具体机制尚不清楚.DHPS和DHFR基因突变增加可能是药物选择性压力所致,也可能是耶氏肺孢子菌基因多态性自然发展和传播的结果.本文对耶氏肺孢子菌 DHPS 和DHFR基因突变产生的原因、分子流行病学研究进展及其与临床结局的关系进行了综述.
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神经管发育不良患儿及其核心家庭MTHFR基因A1298C多态性分布的研究
目的通过对神经管发育不良(NDTs)患儿及核心家庭MTHFR基因A1298位点多态性分布的研究,探讨该基因多态性与NDTs之间的关系.方法2000年9月～2002年3月,40例3～15岁NDTs患儿(男28例,女12例)及其中26个核心家庭进行研究.应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术,分析MTHFR基因第1298位核苷酸基因型(野生型、杂合型、突变纯合型)的分布情况;并对26个核心家庭进行以父母为对照的病例对照研究,计算传递失衡指数(TDT)及基于单体型的单体型相对危险度(HHRR).结果NDTs患儿、核心家庭与正常对照中均未发现纯合突变.基因型构成比采用x2检验,NDTs患儿及患儿母亲野生型分别占17.50%,11.54%,杂合型分别占82.50%,88.46%,与正常对照之间差异无显著性意义(分别为P＞0.25;P＞0.90).患儿父亲野生型占30.77%,杂合突变型占69.23%,低于正常对照(P＜0.05).等位基因频率比较采用u检验,患儿为41.25%,与对照间差异无显著性意义(P＞0.05);患儿父母分别为69.23%,88.46%,均高于正常对照(P＜0.01).核心家庭分析结果:TDT(x2)=0.36,P＞0.05;HHRR(x2)=0.369,P＞0.05.结论MTHFR基因第1298位核苷酸基因型的多态性分布在神经管发育不良患儿与正常对照间不存在差异.突变等位基因1298C在神经管畸形核心家庭中不存在突变基因(C)的遗传失衡现象.MTHFR基因第1298位核苷酸的多态性与神经管畸形的发生没有直接关系.
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肾透明细胞癌中分泌型卷曲相关蛋白1基因甲基化及其表达与亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性的关系
目的 探讨人肾透明细胞癌组织中分泌型卷曲相关蛋白1基因(SFRP-1)的甲基化状态及其mRNA表达与亚甲基四氢叶酸还原酶C677T (MTHFR C677T)基因多态性的关系.方法 采用PCR-RFLP技术分别检测38例手术切除的肾透明细胞癌区和外周正常肾脏组织标本MTHFR基因677(C→T)多态,并分别以Real-time PCR和和甲基化特异性PCR (MSP)技术检测SFRP 1基因的表达和甲基化状态.结果 SFRP 1基因失表达和/或低表达的肾透明细胞癌组织其启动子区处于高甲基化状态,MTHFR 677CC基因型的肾透明细胞癌组织SFRP 1甲基化升高且其表达降低,SFRP 1的甲基化及其表达与MTHFR C677T基因多态性有明显相关性.结论 MTHFR基因多态性通过影响SFRP 1基因的甲基化状态而调控其表达,可能在肾癌的发生、发展中具有重要作用.
