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自身反应性T细胞系免疫生物学活性研究
目的探讨自身反应性T细胞系过继转移对受体小鼠免疫应答的影响,为在BXSB小鼠探索T细胞疫苗的可行性奠定基础. 方法应用体外扩增的自身反应性T细胞过继转移给同系小鼠体内;3H-TdR掺入法检测细胞增殖;ELISA检测抗体和细胞因子水平. 结果将自身反应性T细胞系过继转移到年轻未发病的同系小鼠体内可以诱导血清中自身抗体和外来抗原反应性抗体以及细胞因子IFN-γ水平显著升高,可以降低受体小鼠对外来抗原(OVA)体液免疫应答能力. 结论自身反应性T细胞的过继转移可以影响机体自身免疫应答和对外来抗原的体液免疫应答能力.
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自身反应性T细胞系及克隆的建立与TCR使用情况分析
目的体外建立可长期生长的自身反应性T细胞系及克隆,并分析其T细胞受体的使用情况.方法用狼疮小鼠BXSB自身脾脏作为刺激细胞,在体外建立长期生长的自身反应T细胞系(ATL),通过有限稀释法进行克隆,应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体应用.结果建立了H-2b限制性的自身反应性T细胞系和2个T细胞克隆.T细胞系主要应用TRBV2S1、TRAV5S1和TRAVl0S1,而2个T细胞克隆均为TRBV2S1和TRAV10S1.分析其表型为CD3+CD4+CD28+.结论从狼疮小鼠获得了自身反应性T细胞系及克隆,其T细胞受体利用具有一定的局限性.
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类风湿关节炎患者T细胞抗原受体BV基因的限制性取用初步研究
目的研究类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者病灶部位即关节滑膜组织浸润的受某种自身抗原驱动的T淋巴细胞抗原受体(T cell receptor,TCP)β链的取用格局.方法采用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法分析RA患者病灶部位T淋巴细胞抗原受体β链的取用;采用PCR-SSP方法对所调查的RA患者的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)进行了分型.结果研究发现中国人群RA患者病灶关节滑膜浸润的T淋巴细胞抗原受体主要取用BV14和BV16家族;中国人群RA患者HLA基因型主要以HLA DRB1*0405为主要特征,与白种人RA患者不同.结论研究提示中国人群RA患者病灶区自身反应性T细胞具有TCR BV14和BV16的限制性取用,其中TCR BV16的偏移为国内外首次报道.而HLA DRB1*0405类风湿关节炎患者表现出TCR BV16取用的趋势,提示TCR BV16取用受主要组织相容性复合体(MHC)的约束,这为进一步分析诱发RA的发生的免疫异常和自身反应性T细胞的生物学特性提供了重要试验基础.
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大鼠T细胞受体Vβ5.2-HSP70和Vβ8.2-HSP70基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建含大鼠TCR Vβ 5.2-HSP70和TCR Vβ 8.2-HSP70基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达.方法:实验于2005-10/2006-09在首都医科大学免疫学系实验室完成.①以自主构建的重组表达载体pTARGET-TCRVβ5 2和pTARGET-TCR Vβ 8.2为模板,将结核杆菌HSP70的一段保守序列P111-125设计到引物中,通过PCR的方法得到TCR Vβ 5.2-HSP70和TCR Vβ 8.2-HSP70基因片段,将其插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ 5.2/8.2-HSP70.②将BALB/c小鼠48只随机分为4组,pTARGET-TCR Vβ 5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ 8.2-HSP70组和空质粒组肌注相应的质粒DNA 100 μg/次,PBS组注射PBS缓冲液100 μL/次.共注射3次,每次间隔2周.于末次免疫后3 d取注射部位的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ 5.2/8.2-HSP70基因在注射部位的转录和表达.③将COS-7细胞分为pTARGET-TCR Vβ5 2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ 8.2-HSP70组、空质粒组和未转染细胞组,进行相应质粒转染,24 h后收集细胞,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达.结果:①TCR Vβ 5.2/8.2-HSP70基因已被正确插入到pTARGET载体中.②pTARGET-TCR Vβ 5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ 8.2-HSP70组小鼠免疫处的肌肉组织RT-PCR检测显示,在500～600 bp和400～500 bp处出现特异的扩增带,分别与TCR Vβ 5.2-HSP70和TCR Vβ 8.2-HSP70基因片段的大小相符,而注射空质粒组和PBS组均未见此条带.③免疫组化结果显示转染重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70的COS-7细胞的胞质及胞膜都有明显的着染.结论:成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70,并在体内外检测到其转录和表达,为进一步进行TCR DNA疫苗治疗胶原诱导性关节炎的实验研究奠定了基础.
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STZ诱导小鼠糖尿病模型中T、B淋巴细胞功能的变化
目的:探讨多次小剂量注射链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型小鼠中T、B淋巴细胞功能的变化及可能的机制,为小鼠糖尿病模型的应用提供实验依据.方法:①采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导昆明小鼠糖尿病作为动物模型.②用ConA和Insulin分别刺激脾和胸腺T细胞,采用MTT法检测成熟与未成熟T细胞对于丝裂原和特异性抗原的增殖转化能力.③采用ELISA间接法测定血清中Insulin自身抗体(IAA)的水平.④采用ELISA夹心法测定小鼠脾细胞及胸腺细胞培养上清的IL-4与IFN-γ的含量.结果:①糖尿病模型组血清中Insulin自身抗体(IAA)含量明显高于正常组(P＜0.05).②模型组成熟T细胞(脾脏细胞)对于ConA刺激的增殖能力较弱(P＜0.05),对于Insulin刺激的增殖能力与正常组没有显著差别(P＞0.05);模型组未成熟T细胞(胸腺细胞)对于ConA刺激的增殖能力与正常组没有显著差别(P＞0.05),而对于Insulin刺激的增殖能力较高(P＜0.05).③模型组脾细胞培养上清的IFN-γ的含量明显高于对照组(P＜0.05),而胸腺细胞培养上清中IFN-γ的含量在模型组与对照组之间无明显差异,IL-4在实验组和对照组均未检出.结论:多次小剂量注射STZ诱导糖尿病小鼠模型是自身免疫应答所导致;自身免疫性T、B细胞的功能及自身抗体均有增强;Th1介导的细胞免疫在STZ诱导的糖尿病中发挥着重要作用.
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CⅡ诱导RA患者关节滑液中自身反应性T细胞的免疫学特性分析
目的:探讨CⅡ诱导的RA患者关节滑液中自身反应性T细胞免疫学特性.方法:分离RA患者关节滑液中SFMC,用CⅡ刺激后分析反应性的T细胞频率;用ELISA方法检测CⅡ刺激SFMC后上清中的IFN-γ和IL-4的含量及通过流式细胞检测SFMC表面标志的表达;应用半定量PCR分析外周血及滑膜液中TCR Vβ基因表达格局.结果:SFMC中CⅡ反应性的T细胞频率高于PBL;IFN-γ的含量在CⅡ刺激SFMC后上清中较高,而在未刺激中较低 (P＜0.01),在PBL中更低 (P＜0.05); SFMC上CD8及CXCR3表达多于PBMC(P＜0.05);外周血T细胞表达绝大多数Vβ基因,而滑膜液中TCR Vβ基因取用呈现明显的不均衡性.结论:CⅡ反应性T细胞在SFMC中占优势,可能是介导RA发病的主要原因.
关键词： 类风关 自身反应性T细胞 TCR Vβ gene CⅡ -
可溶性和膜型B7-H3在类风湿关节炎患者外周血中的表达及临床意义
本实验通过检测类风湿关节炎(RA)患者外周血中可溶性B7-H3(sB7-H3)和膜型B7-H3(mB7-H3)的表达及异构体的分布,探讨该分子的异常表达在RA发病中的临床意义.通过收集RA早期患者和健康对照外周血,ELISA方法检测血清中sB7-H3的表达,统计学分析sB7-H3的表达与临床的相关性;同时分离RA患者和健康对照外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),通过流式细胞术检测CD14+的单核细胞膜型B7-H3的变化；通过PCR检测外周血mRNA水平B7-H3两种异构体的表达.结果显示RA患者血清中的sB7-H3分子明显低于健康对照组,RA活动期患者sB7-H3明显低于缓解期患者,并与RA患者肿胀关节数呈负相关；RA患者外周血单核细胞上mB7-H3的表达明显高于健康对照者,RA患者PBMC在mRNA水平B7-H3明显高于健康对照者,主要表达形式为4IgB7-H3.本研究发现膜型和可溶性B7-H3在类风湿性关节炎外周血中异常表达,其可能参与了RA自身免疫性病理的调节.
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雷公藤内酯醇对自身反应性 T细胞的作用机制研究
通过体外实验观察雷公藤内酯醇(Triptolide,Tri)对自身反应性T细胞的作用,为以后将Tri用于体内治疗EAE的研究建立基础.采用CCK-8法检测不同浓度Tri对小鼠成纤维细胞株L929生长的影响;采用MOG35-55肽段免疫C57BL/6小鼠建立EAE疾病模型,获取MOG35-55特异性T细胞,3H掺入法检测Tri对其增殖的影响;ELISA方法检测培养上清中IL-17、IFN-γ、TNF-α、IL-4、TGF-β的含量;流式细胞术检测Tri对Th1和Th17细胞分化的影响.结果Tri浓度≤30nmol/L时,对L929细胞生长未见明显细胞毒性;Tri呈剂量依赖性地抑制MOG35-55特异性T细胞增殖,抑制炎症细胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达,并增加IL-4、TGF-β的表达水平,同时抑制naive T细胞向致病性Th1和Th17细胞的分化.结果表明,Tri可通过抑制MOG35-55特异性T细胞的增殖,改变MOG35-55特异性T细胞分泌细胞因子的格局及抑制Th1和Th17细胞分化的途径影响自身反应性T细胞,从而为Tri体内治疗EAE的研究提供依据,也为临床研究治疗MS药物提供实验基础.
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胸腺与重症肌无力
1672年,英国牛津内科医生Thomas Willis首先描述了第一例女性重症肌无力(myasthenia grayis,MG)患者的临床表现.到目前为止多数学者认为MG是由于神经-肌肉传导障碍而导致的以横纹肌收缩乏力为特征的一种慢性疾病.
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自身免疫性肾炎模型中自身反应性T细胞的克隆诱导及免疫学行为分析
目的了解自身反应性T淋巴细胞(ART)在自身免疫性肾小球肾炎中的可能致病作用,探讨肾脏自身免疫性损伤与致肾炎性ART存在的相关性.方法建立Brown-Norway(BN)大鼠氯化汞(HgCl)自身免疫性肾炎模型.在此基础上,对该模型体内的致肾炎性ART进行克隆诱导以及分离、活化、增殖等处理,并采用动物转输试验、噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术及ELISA法对所获ART的致病性、抗原性以及免疫学行为进行详细分析.结果(1)成功建立了BN大鼠自身免疫性肾炎模型;(2)在BN大鼠自身免疫性肾炎模型中诱导、分离、获得了自身反应性T细胞克隆;(3)发现所获ART克隆对大鼠自身基底膜抗原成分层粘蛋白(laminin)有明显的增殖活性;(4)将所获ART细胞克隆转输至同种正常BN大鼠后,后者出现与原模型鼠相类似的临床、病理改变;(5)细胞表型分析发现所获ART细胞克隆多具有CD3+/CD4+的免疫学特征;(6)与对照组相比,所获ART细胞克隆的培养上清中,主要含有细胞因子IL-4[(455.0±85.1)ng/L比(139.0±46.7)ng/L,P＜0.01)].IFN-γ的分泌量与对照组细胞无明显差异[(124.0±34.6)ng/L比(147±50.3)ng/L,P＞0.05).结论在氯化汞致自身免疫性肾小球肾炎模型中,经定向诱导、分离所获的ART细胞克隆,可呈现明显的抗原特异性及转输致病性.细胞免疫分析显示这些ART克隆的免疫表型主要为CD3+/CD4+,其在体外可分泌大量的Th2型细胞因子IL-4.因此,自身免疫性肾小球肾炎的发病可能与自身反应性T细胞的存在及参与有关.
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自身反应性T细胞及共刺激分子CD28/CTLA-4/B7、CD40/CD40L和ITP
血小板抗原特异性自身反应性T细胞的活化在特发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机制中起着关键性作用,T细胞的活化除需要抗原递呈细胞表面MHC Ⅱ抗原复合物外还需要共刺激分子(第二信号),主要包括CD28/CTLA-4/B7和CD40/CD40L.本文就自身反应性T细胞和共刺激分子CD28/CTLA-4/B7、CD40/CD40L在ITP中的作用机制及潜在的治疗价值作一综述.
关键词： 特发性血小板减少性紫癜 自身反应性T细胞 共刺激分子 -
大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建含大鼠TCR Vβ 8.2基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达.方法:以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ 8.2基因片段,插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ 8.2,并转化E.coli JM109,经蓝白斑筛选阳性菌落,进行菌落PCR和测序鉴定.将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠,采集注射部位股四头肌处的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ 8.2基因在注射部位的转录和表达.通过脂质体介导,将重组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达.结果:测序鉴定证实,TCR Vβ 8.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达.结论:成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ 8.2,并在体内体外均可检测到其转录和表达,为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础.
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协同刺激分子B7-H3在重症肌无力患者外周血中的表达
[目的]检测重症肌无力(MG)患者外周血中协同刺激分子B7-H3的表达,并探讨其临床意义.[方法]收集35例MG患者和44例健康对照(HC)外周血标本,采用免疫荧光标记,流式细胞检测外周血单个核细胞模型B7-H3( mB7-H3)的表达,ELISA法检测MG和HC血浆中可溶性B7-H3(sB7-H3)的含量.[结果]MG患者外周血T淋巴细胞、单核细胞和B淋巴细胞上mB7-H3低水平表达,与HC无差异；MG患者外周血sB7-H3浓度为(2.166±0.958) ng/mL,显著低于HC (3.379±0.768) ng/mL；全身型MG(GMG)sB7-H3的浓度为(1.664±0.699)ng/mL,低于眼肌型MG(OMG)(2.396±0.985)ng/mL；并发胸腺异常的MG sB7-H3浓度为(1.593±0.441) ng/mL,低于胸腺正常MG(2.364±1.014) ng/mL; MG sB7-H3含量与QMGS评分呈负相关(r=-0.4189,P=0.012)；免疫细胞mB7-H3与血浆sB7-H3无相关性.[结论]MG患者sB7-H3表达下调,与疾病严重程度相关；在不同病理类型MG患者体内存在差异性表达,提示该分子可能参与了MG的免疫病理进程.
