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非霍奇金淋巴瘤病人外周血T细胞TCR Vβ谱系的选择性利用和克隆性增殖分析
为了解B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)病人TCRVβ亚家族T细胞的分布及其克隆性的情况,利用RT-PCR分别扩增4例B-NHL和2例T-NHL病人外周血单个核细胞的TCRVβ 24个亚家族基因的CDR3,了解病人各Vβ亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,以了解T细胞克隆性.结果显示,6例NHL病人外周血T细胞仅选择性表达6-12个Vβ亚家族,全部病人均选择了表达Vβ1,Vβ8,Vβ13和Vβ19,5例病人表达Vβ2和Vβ16,而全部病人均未能检测到Vβ4-6,Vβ10-12,Vβ15,Vβ17-18,Vβ20,Vβ22-23.基因扫描发现2例B-NHL和1例T-NHL病人的1-3个Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖.结论提示,B-NHL和T-NHL病人外周血T细胞具有相似的Vβ亚家族选择性利用的特点,部分病人存在与肿瘤细胞抗原相关的克隆性增殖的T细胞.
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利用基因扫描技术分析类风湿关节炎T细胞受体的表达
目的通过研究T细胞Vβ的表达探讨类风湿关节炎的发病机制,为新的治疗手段提供一定的理论基础. 方法应用半定量的逆转录多聚酶链反应及基因扫描技术分析类风湿关节炎、骨关节炎、截肢病人滑膜及外周血中T细胞受体Vβ基因的表达情况以及T细胞的克隆性,并选择呈现单克隆或寡克隆的部分Vβ基因进一步克隆与测序. 结果滑膜组织与外周血T细胞表达绝大多数Vβ基因.类风湿关节炎病人滑膜组织中Vβ基因的表达呈现更明显的不均衡状态,Vβ6、Vβ 17与Vβ 22为优势亚群,其中以Vβ 17的高水平表达为突出.大多数阳性表达的Vβ基因均呈多克隆性. 结论类风湿关节炎病人滑膜组织中Vβ基因表达无限制性,但是存在明显的不均衡性,某些特定Vβ基因的选择性表达支持类风湿关节炎为抗原或超抗原驱动的免疫过程.
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CD28/CD80和CD2/CD58活化PBLs作用肝癌细胞的表型分析与TCR Vβ基因亚家族的优势取用
目的采用抗CD28,CD80,CD2及CD58分别刺激健康人PBLs后作用肝癌细胞,对作用前后PBLs的表型变化及TCR Vβ基因亚家族的表达水平进行探讨.方法用FACS分析作用肝癌细胞前后PBLs表型变化,并用RT-PCR-Southern印迹分析其TCR Vβ1～20的表达水平及特征.结果健康人PBLs作用肝癌细胞后CD3和CD8分子表达比作用前明显增高,而CD4分子无显著变化.健康人PBLs分别加IL-2,PHA,抗CD3和CD3+CD28,CD28+CD80,CD2+CD58作用肝癌细胞(BEL-7402)前表达水平平均约5%,作用BEL-7402后表达水平约13%～25%,其特征为Vβ7增高.结论在癌抗原的参与下,McAb共刺激的T细胞活化,TCR接受APC提呈的相应抗原的刺激,具有该TCR的淋巴细胞迅速增殖而成为针对抗原的T细胞克隆,发挥其识别和杀伤癌细胞的作用.
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活化PBL作用肝癌细胞的表型分析与TCR Vβ基因亚家族的优势取用
目的采用抗CD28,CD80,CD2及CD58分别刺激健康人PBL后作用肝癌细胞,对作用前后PBL的表型变化及TCR Vβ基因亚家族的表达水平进行探讨.方法用FACS分析作用肝癌细胞前后PBL表型变化,并用RT-PCR-Southern印迹分析其TCR Vβ1-20的表达水平及特征.结果健康人PBL作用肝癌细胞后CD3和CD8分子表达比作用前明显增高,而CD4分子无显著变化.健康人PBL分别加IL-2,PHA,抗CD3和CD3+CD28,CD28+CD80,CD2+CD58作用肝癌细胞(BEL-7402)前表达水平平均约5%,作用BEL-7402后表达水平约13%～25%,其特征为Vβ7增高.结论在癌抗原的参与下,mAb共刺激的T细胞活化,TCR接受APC呈递的相应抗原的刺激,具有该TCR的淋巴细胞迅速增殖而成为针对抗原的T细胞克隆,发挥其识别和杀伤癌细胞的作用.
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苯致再生障碍性贫血患者T细胞受体Vβ亚家族基因的表达
目的比较苯中毒所致再生障碍性贫血(再障)患者与原发再障患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ亚家族基因不同期间的表达.方法采用RT-PCR扩增1例苯中毒所致再障患者与1例原发再障患者发病初期和骨髓恢复后的不同期间外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族的互补决定区3(CDR3),产物进一步经基因扫描分析T细胞的克隆性,并与10名正常人比较.结果健康人表达全部Vβ亚家族,PCR产物呈多峰图像(多克隆).苯中毒所致再障患者发病初期出现Vβ表达受抑制的情况不明显,但PCR产物出现多个单峰图像(寡克隆)或双峰图像(双克隆)的异常克隆性改变占41%,提示苯对机体的刺激作用而引起机体的相应的细胞免疫反应.随着病情恢复重新出现多克隆.原发再障患者发病初期出现9个亚家族表达受抑制,但其克隆性的改变绝大多数表现为多克隆图像,提示免疫功能不同程度受损,在骨髓恢复后可见受抑制的亚家族基因重新得到恢复,出现多克隆的多表达图像.结论苯中毒再障和原发再障患者外周血TCR Vβ亚家族基因表达有所差异,为进一步研究两者的免疫诊治提供了参考.
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苯接触工人外周血T细胞受体TCR Vβ亚家族基因多态性分析
目的了解苯接触工人外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性,寻找防治苯中毒的免疫指标.方法采用RT-PCR扩增6例不同工龄低浓度苯接触工人外周血单核细胞的TCR Vβ 24个亚家族的互补决定区3(CDR3),产物进一步经基因扫描分析确定T细胞的克隆性,并与8名健康人作对照.结果 8名健康者表达全部Vβ亚家族,PCR产物呈多峰图像(多克隆).苯接触工人随工龄不同,外周血损伤的情况不同而出现Vβ表达减少,PCR产物出现寡克隆或双克隆改变.结论低浓度苯接触工人的外周血T细胞的TCR Vβ亚家族表达出现限制性,部分Vβ亚家族呈克隆性增殖,可能由于苯损害T细胞而造成机体免疫的不同改变.该方法有望成为预防和诊治苯中毒的一项免疫指标.
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霉酚酸酯治疗GVHD及其分子机制的初步研究
初步探讨霉酚酸酯(MMF)治疗GVHD的分子机制.采用MMF每日1～2 g,并应用RT-PCR扩增3例GVHD患者MMF使用前后外周血单个核细胞的TCR Vβ 24个亚家族的CDR3,了解患者TCR VB T细胞的分布情况.结果表明,患者在GVHD发生前,有TCR Vβ3及其他亚家族基因表达,MMF治疗后,GVHD得以缓解,Vβ3不表达;当患者GVHD复发时,Vβ3基因又表达,治疗后不表达.MMF作用的分子机制可能与抑制TCR Vβ亚家族基因表达有关,TCR Vβ3可能是MMF作用的靶基因.
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Hela细胞诱导下TCR Vβ基因的选择性表达与重排研究
目的 研究Hela细胞诱导下T细胞受体(Tcell receptor,TCR)Vβ亚家族基因的优势表达规律,并探讨其是否与重排激活基因（RAGs）介导的TCR重排相关.方法 将Hela细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养,利用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）检测共培养前后TCR Vβ各亚家族基因、重排激活酶RAGs、非同源末端连接（non-homogousend joining,NHEJ）途径中的核心蛋白Ku70/Ku80及末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT）等的表达特点.结果 随着混合培养时间的推移,TCR Vβ各亚家族基因由初的全部表达逐渐转变为选择性的部分表达,其中,TCR Vβ7在各时间段都有明显的表达；Ku70随着培养时间的推移表达量逐渐减少直至没有表达；而RAGs、kuS0和TdT基因在各个时间段均未检测到其表达.结论 在Hela细胞诱导下,TCRVβ各亚家族基因的表达有一定的选择性但无明显的特异性,该选择性表达可能与RAGs介导的二次重排无关.
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肺癌患者TCR Vβ亚家族表达及记忆性T细胞表达的研究
目的 探讨肺癌患者外周血T细胞及胸水肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的T细胞受体(TCR)Vβ亚家族及记忆性T细胞的表达情况.方法 分离健康人和肺癌患者的T细胞,采用流式方法检测Vβ24个亚家族及CD45RO和CD28的表达情况,统计分析Vβ24个亚家族及记忆性T细胞的特点.结果 43例肺癌患者外周血TCR Vβ亚家族主要高表达Vβ3(11/43)、Vβ9(12/43)、Vβ13.2(7/43);15例胸水TIL主要高表达Vβ3(5/15)、Vβ9(3/15)、Vβ21.3(3/15);肺癌组记忆性T细胞(29/35)多于健康对照组(4/35)(P＜0.05).结论 肺癌患者TCR Vβ亚家族存在选择性表达的情况;肺癌患者以记忆性T细胞为主.推测这种高表达Vβ亚家族的T细胞可能部分是记忆性T细胞.
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识别肿瘤相关抗原TCR Vβ基因亚家族表达特征的研究
目的:探讨特异性识别肝癌和不同组织肿瘤相关抗原(TAA)的TCR Vβ基因亚家族的表达特征.方法:用McAb共激活的健康人PBLs,作用于肝癌细胞系BEL-7402和HepG2-2215,以及将不同肿瘤患者PBL8,用RT-PCR、Southern印迹分析TCR Vβ基因亚家族识别癌抗原的优势取用.结果:不同的肝癌细胞系和不同的肝癌患者TCR Vβ7、Vβ15表达较高,而另外两例非肝癌患者TCR Vβ7表达而Vβ15不表达.结论:TCR Vβ7可能是TAA的识别基因,而Vβ15可能为肝癌抗原的识别基因.
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NB4和HL - 60细胞诱导的脐血T细胞TCR Vβ基因谱系分析
目的:了解经NB4细胞和HL-60细胞体外诱导后脐血T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况.方法:采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,用经丝裂霉素灭活的NB4细胞和HL-60细胞体外诱导脐血T细胞增殖,利用RT-PCR分析经MLTC前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族的利用情况,并用基因扫描分析其克隆性特点.结果:诱导前脐血T细胞表达20个TCR Vβ亚家族,诱导后的T细胞所表达的TCR Vβ亚家族随培养时间增加而逐渐减少,且诱导组呈现出克隆趋势或寡克隆增殖特点.两种细胞诱导后10 d均可见Vβ1的克隆增殖出现变化,此外,NB4诱导的T细胞出现Vβ15,而HL-60诱导的T细胞则出现Vβ23的克隆增殖情况.结论:NB4细胞和HL-60细胞可诱导脐血TCR VβT细胞克隆性增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与特异性抗原介导的细胞免疫反应有关.
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晚期肺癌患者胸水及外周血中T细胞受体(TCR)Vβ亚家族表达的对比研究
目的 探讨晚期肺癌患者(Ⅲ～Ⅳ期)胸水及外周血中T细胞受体Vβ亚家族的表达,比较二者的异同.方法 收集2010年7月至2012年5月共89例临床诊断为肺癌晚期的患者胸水及外周血标本,采用流式细胞仪方法测定其T细胞受体Vβ亚家族的表达情况,统计分析胸水及外周血中Vβ亚家族表达的异同.结果 89例晚期肺癌外周血和胸水均主要高表达Vβ3和Vβ9,分别为Vβ3 (16/89)、Vβ9 (18/89)和Vβ3 (20/89)、Vβ9 (15/89);患者胸水与外周血Vβ亚家族存在差异,部分差异有统计学意义(P＜0.05),部分差异无统计学意义(P＞0.05),其中胸水中Vβ3的高表达相对于患者外周血和健康人差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 晚期肺癌患者胸水及外周血中Vβ亚家族的表达不全相同；晚期肺癌胸水中的高表达Vβ亚家族少于外周血,其中Vβ3在胸水中可能有特异性.此研究为晚期肺癌的生物治疗及T细胞过继免疫疗法在临床中的应用奠定理论基础.
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结核胸液中结核抗原刺激后CD4+T细胞克隆性分析
目的 检测结核抗原刺激后结核性胸膜炎病人胸液细胞中CD4+T细胞受体的表达情况,了解CD4+T细胞在结核局部细胞免疫应答中的作用.方法 分离结核性胸膜炎病人胸液细胞(PFCs),对比BCG和结核特异性抗原(ESAT-6/CFP10混合单肽)刺激前后CD4+T细胞受体表达特征,并对刺激后部分PCR产物序列进行分析.结果 3例结核性胸膜炎患者胸液细胞未经任何刺激的条件下分别表达17～21个TCR Vβ亚家族,各存在1～2个Vβ亚家族呈现寡克隆增殖趋势.经BCG或ESAT-6/CFP 10混合单肽刺激后,患者均出现4～5个寡克隆Vβ亚家族.不同患者选择性刺激的Vβ亚家族不同.结论 BCG和ESAT-6/CFP10混合单肽可分别诱导结核性胸膜炎患者不同TCR Vβ亚家族细胞寡克隆增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与不同结核抗原介导的特异性细胞免疫反应有关.
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AML-M1相关TCR Vβ克隆性增殖T细胞的研究
目的了解急性髓细胞白血病M1亚型(AML-M1)患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性分布特点.方法采用RT-PCR扩增9例M1患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因,分析其TCR Vβ亚家族的利用情况.PCR产物进一步经基因扫描分析,了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性.结果不同标本中可检测到 2～5个Vβ亚家族T细胞,以Vβ2、Vβ3、Vβ17和Vβ19为常见,并在Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8、Vβ9和Vβ19中发现克隆性生长T细胞.结论 M1病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞表达呈现明显的选择性和克隆性增殖情况,这可能与M1细胞相关抗原有关,且克隆性增殖Vβ亚家族分布以个体特异性为主.
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CD28与B7.1共刺激PBLs受肝癌细胞诱导后的TCR Vβ基因表达
目的研究T细胞受体(TCR)Vβ在外周血淋巴细胞(PBLs)中的表达.方法用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞(BEL-7402).结果发现PBLs TCR Vβ7基因在体外选择性扩增,表达水平为15%～25%,对照组为4%～8%.结论Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性,为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据.
关键词： TCR Vβ基因 CD28+B7.1(CD80) 基因表达 -
TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人胸腺、脐血和外周血中的检测情况
目的建立检测TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的方法,分析其在胸腺细胞、脐血和正常人外周血T细胞中的存在情况,从而了解近期胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naive T细胞的情况.方法利用半巢式PCR分别扩增3例正常胸腺细胞、10例脐血和10例正常人外周血单个核细胞DNA中的Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ21基因片段重排时产生的sjTRECs.结果在正常胸腺细胞、脐血和正常人外周血单个核细胞中均可检测到Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1片段形成的sjTRECs,其中胸腺细胞和脐血单个核细胞DNA中3种删除环的检出率均为100%,正常人外周血3种删除环的检出率分别为50%、70%和40%.结论成功地建立检测3种Vβ-Dβ1 sjTRECs的方法,并提供了Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs在胸腺、脐血和外周血中的检测情况.
关键词： TCR Vβ基因 Naive T细胞 T细胞受体删除DNA环 -
职业铅接触工人外周血T细胞Vβ基因谱系明显缺失
目的:分析职业铅接触工人外周血中T细胞受体Vβ基因(TCR Vβ)谱系分布和克隆性特点,进一步了解铅接触后对T细胞免疫的影响.方法:利用RT-PCR分别检测6例职业铅接触工人和6例健康体检者的外周血中各TCR Vβ亚家族的表达情况；阳性产物经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度以了解T细胞克隆性.结果:所有健康体检者均可检测到24个Vβ亚家族并呈多克隆,而6例职业铅接触工人外周血TCR Vβ亚家族表现明显的限制性利用,仅能检测到1～7个,并且多数所检测到的Vβ亚家族T细胞呈现为寡克隆或双克隆增殖,发生克隆性改变的亚家族主要集中在Vβ1和Vβ16.结论:职业铅接触可能在不同程度上影响机体TCR Vβ谱系的利用和克隆性改变,可能与铅的免疫毒性有关.
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大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建含大鼠TCR Vβ 8.2基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达.方法:以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ 8.2基因片段,插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ 8.2,并转化E.coli JM109,经蓝白斑筛选阳性菌落,进行菌落PCR和测序鉴定.将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠,采集注射部位股四头肌处的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ 8.2基因在注射部位的转录和表达.通过脂质体介导,将重组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达.结果:测序鉴定证实,TCR Vβ 8.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达.结论:成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ 8.2,并在体内体外均可检测到其转录和表达,为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础.
