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蛋白激酶Cθ信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人γδT细胞增殖和分化中的作用
目的 研究蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)信号途径在结核分枝杆菌抗原(Mycobacterium tuberculosis antigen,Mtb-Ag)激活人γδT细胞增殖和分化中的作用.方法 健康人外周血单个核细胞(PBMC)用Mtb-Ag和IL-2优势刺激和扩增γδT细胞,或预先用5.0μmol/L Rottlerin(楸毒素)预处理,培养不同时间后,用流式细胞术(FCM)检测γδT细胞表面活化分子和细胞因子表达;同时采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记细胞,流式细胞术分析Mtb-Ag刺激γδT细胞后的增殖和各子代细胞百分率.结果 PBMC经Mtb-Ag刺激后3d,γδT细胞CD69和CD25表达分别为46.2%和45.6%,而Rotderin预处理显著地抑制了CD69和CD25表达(P＜0.01);PBMC经Mtb-Ag激活培养5、10和15d,培养扩增细胞中的γδT细胞比例分别为9.6%、54.6%和82.4%,其中第5天已有少部分γδT细胞发生增殖,第10天和第15天时几乎全部γδT细胞分裂都在6代以上,用Rottlerin预处理,显著抑制了γδT细胞增殖反应,但在培养第10天后仍有少部分γδT细胞发生增殖反应;同时在培养第7天、14天和21天,用PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)再刺激后,产生IFN-γ的γδT细胞均在80%左右;培养21d时,有2.6%的γδT细胞表达IL-4.在Rottlerin预处理组产生TH1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞均显著减少(P＜0.05),而γδT细胞表达TH2型细胞因子IL-4则几乎完全抑制(P＜0.01).结论 PKCθ信号途径在Mtb-Ag刺激γδT细胞的增殖和分化中均起重要作用.
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蛋白激酶Cθ及其抑制剂的研究进展
自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫反应而引起的一系列慢性疾病,T、B 淋巴细胞过度活化,自身抗体的产生是该病主要的病理生理学表现.此类疾病发病机制复杂,可累及机体多个系统和器官,具有较高的致残率和致死率.免疫抑制剂的发现和应用极大地缓解了自身免疫性疾病患者的症状,可显著提高患者生活质量.
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蛋白激酶Cθ对胃肠道间质瘤的诊断价值
目的:通过Meta分析方法评价蛋白激酶Cθ对胃肠道间质瘤的诊断价值.方法:检索Pubmed数据库、万方数据库、维普数据库、CBM以及CNKI数据库,搜集1998-2010年国内外公开发表的以病理诊断结果为金标准的关于蛋白激酶Cθ诊断胃肠道间质瘤的英文、中文文献,按照Meta分析的要求和诊断试验公认的质量标准对所有的纳入研究进行质量评估.采用Meta-disc1.4软件进行数据分析,得到合并的诊断敏感度和特异度、合并的阳性和阴性似然比以及合并的比数比,并绘制接受者工作特征(SROC)曲线.结果:共纳入9篇(2001-2008年)国内外有关蛋白激酶Cθ诊断胃肠道间质瘤的文献,涉及研究对象1 141例.9篇文献研究结果存在异质性(P=0.0042,I2=64.3%).利用随机效应模型合并的诊断敏感度和特异度分别为93%(95%CI:91%-95%)、93%(95%CI:91%-95%),合并阳性似然比为12.47(95%CI:6.30-24.70),合并阴性似然比为0.10(95%CI:0.05.0.17).合并比数比为138.19(95%CI:52.75-362.04).加权SROC面积为0.9713(SE=0.0116).结论:蛋白激酶Cθ可作为敏感度以及特异度均高的标记物用于胃肠道间质瘤的诊断.
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化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PKCδ、PKCθ和PKCε表达的影响
目的 探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠蛋白激酶(PK)Cδ、PKCθ和PKCε表达的影响及其神经保护机制.方法 以改进后的Zea-Longa线栓法制造局部梗死性脑缺血再灌注模型.随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组,中药高剂量组、中剂量组、低剂量组,以Longa评分法进行神经功能评分,免疫组化法观察PKCδ、PKCθ和PKCε的分布及表达.Western印迹法评测其在各组大鼠缺血侧脑组织中的表达量.结果 免疫组化结果显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05).Western印迹法显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05).结论 化浊解毒活血通络方可能通过降低PKCδ、PKCθ的表达、上调PKCε的表达,降低CIRI的程度.
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胃癌组织细胞外信号调节激酶1/2表达及其与幽门螺杆菌关系的初步分析
目的 探讨胃癌发生、发展过程中细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)表达及其与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)的关系.方法 采用免疫组化SP两步法对比观察单纯性胃炎(20例)、胃黏膜上皮肠上皮化生(肠化)(20例)、不典型增生(28例)、早期胃癌(36例)、进展期胃癌(73例)中HP、ERK1/2、蛋白激酶Cθ(Protein kinase Cθ,PKCθ)的表达.结果 不典型增生组(39.29％)和肠化组(30.00％) HP检出率均明显高于单纯胃炎组(5.00％)、早期胃癌组(2.78％)和进展期胃癌组(1.39％)(P＜0.05).单纯胃炎组、肠化组和不典型增生组ERK1/2染色阴性;早期胃癌组(63.88％)和进展期胃癌组(68.49％)癌细胞呈ERK1/2阳性着色.低分化腺癌组(82.50％) ERK1/2表达明显高于高分化腺癌组(51.52％)(P＜0.05).对各组标本进行PKCθ免疫组化染色后,发现PKCθ仅在早期胃癌和进展期胃癌的间质及癌周淋巴细胞中阳性着色.高分化腺癌组PKCθ表达(54.55％)明显高于低分化腺癌组(32.50％)(P＜0.05).结论 HP感染导致慢性胃炎、肠化、不典型增生.在胃癌的发生、发展过程中可能涉及ERK1/2的高表达.PKCθ在胃癌中的意义尚需进一步研究.
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PKCθ-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中的表达及其对细胞形态的影响
目的:分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与蛋白激酶C-θ (PKCθ)的融合蛋白(PKCθ-EGFP)在HeLa细胞中的表达、亚细胞定位及其对细胞形态的影响.方法:用脂质转染胺(LipofectAMINE 2000)为载体分别以pPKCθ-EGFP和pEGFP-N1转染HeLa细胞,流式细胞仪分析其表达率,激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位,同时分析二丁酸佛波醇酯(PDB)和小檗碱对其亚细胞定位和细胞形态的影响.结果:转染pEGFP-N1或pPKCθ-EGFP的HeLa细胞48 h后,表达绿色荧光的细胞百分率分别为(70.9±4.4)%和(45.8±2.3)% (P<0.05).表达的PKCθ-EGFP融合蛋白均匀分布于细胞内,与EGFP蛋白在细胞内的分布相似.PDB刺激30 min后,表达PKCθ-EGFP的HeLa细胞的形态发生显著变化,即由原来的梭形变成圆形,荧光强度增强.但表达EGFP的HeLa细胞的形态及荧光分布均不受影响.小檗碱对PDB诱导的HeLa细胞的形态和EGFP-PKCθ融合蛋白的分布无明显影响.结论:表达PKCθ-EGFP融合蛋白的HeLa细胞在PDB作用下细胞形态发生显著变化.
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PKCθ激活γδT细胞转录因子NF-κB的作用
目的:探讨经T细胞受体(TCR)途径激活人γδT细胞时,新型蛋白激酶PKCθ在促进转录因子NF-κB活化中的作用.方法:常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),用结核杆菌耐热性多肽抗原(MtbAg)诱导扩增,获得Vγ9Vδ2 T细胞富集的细胞群(MtbAT).PKCθ抑制剂(Rottlerin)预处理MtbAT,抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激后收集细胞,通过电泳迁移率变动分析(EMSA)检测转录因子NF-κB活性变化;经流式细胞术(FCM)检测T细胞活化分子CD69的表达情况.结果:γδT细胞经抗CD3 mAb刺激,NF-κB活性增强;Rottlerin预处理使抗CD3 mAb诱导的NF-κB活化程度显著减弱,并抑制T细胞活化分子CD69的表达.结论:PKC0在人γδT细胞经TCR途径激活NF-κB过程中具有重要作用.
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骨髓增生异常综合征和再生障碍性贫血患者蛋白激酶Cθ及Th1/Th2、Tc1/Tc2类细胞因子的表达
目的 分析骨髓增生异常综合征( MDS)及再生障碍性贫血(AA)患者外周血单个核细胞( PBMC)蛋白激酶Cθ (PKCθ)的表达及Th1/Th2、Tc1/Tc2的变化,探讨PKC θ在MDS及AA发病机制中的作用.方法 收集外周血标本,MDS-RA 14例,AA 15例,健康人30名,分离PBMC,实时荧光定量PCR方法检测PKC θ mRNA表达水平；流式细胞术检测Th1/Th2类细胞因子和Tc1/Tc2类细胞因子的表达水平.结果 MDS及AA患者PBMC中PKC θ mRNA相对表达量较健康对照组升高(AA组为23.54±1.01,MDS组为23.76±1.58；健康对照组为27.12±1.12,P=0.004)；不同组间Th1、Tc1类细胞因子表达差异有统计学意义(均P＜ 0.05).不同组间Th2、Tc2类细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10分泌水平与健康对照组差异无统计学意义(均P＞0.05)；MDS及AA患者组间PKC θ mRNA表达及Th1/Th2,Tc1/Tc2类细胞因子表达差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 MDS及AA患者PBMC中PKC θ表达增高,Th1、Tc1细胞相关细胞因子分泌增加.
