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分泌型重组多肽sPD-1-CellⅠ(P/C-1)调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤效应的研究
目的 构建双结构域重组多肽sPD-1-CellⅠ(P/C-1)分泌型真核表达载体,并研究体内外表达重组多肽在调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤方面的作用和机制.方法 用PCR方法分别扩增出编码PD-1胞外结构域的cDNA与编码CH50 CellⅠ结构域的cDNA,3片段连接法插入分泌型真核表达载体pSecTag A中,获得真核表达载体pP/C-1;脂质体介导体外转染BHK细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR及免疫印迹检测重组多肽P/C-1的表达,MTT法检测表达产物对脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响,建立小鼠H22肝细胞癌移植瘤模型,裸DNA肌肉注射法分别于体内转染sPD-1、CH50和P/C-1基因,观察并比较各处理因素对小鼠的肿瘤生长的抑制作用.结果 酶切及测序鉴定结果表明重组多肽P/C-1真核表达载体构建成功,在BHK细胞培养上清中检测到重组多肽P/C-1的表达,后者能显著增强脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞对H22细胞的杀伤作用,体内实验表明,P/C-1转染对肿瘤生长的抑制作用强烈而持久,显著优于sPD-1和CH50治疗组.结论 重组多肽P/C-1真核表达载体构建成功,表达产物P/C-1兼有sPD-1和CH50的生物学功能,能够激活巨噬细胞和脾淋巴细胞,发挥二者协同抗肿瘤作用,从而将非特异性和特异性抗肿瘤免疫有机地结合起来,为肿瘤基因治疗提供新的思路.
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重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化
目的 应用基因重组技术,构建pET30a(+)与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a(+)载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta (DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a(+)与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.
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三结构域重组纤连蛋白多肽在大肠杆菌中表达及其产物的纯化与鉴定
在大肠杆菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽--人纤连蛋白(FN)的Cell I-Hep Ⅱ-Cell Ⅱ三结构域重组多肽(CH82),表达效率达21%.在低温(22 ℃)培养表达时,CH82大部分为可溶性产物,经DEAE-52层析及 Heparin-agarose亲和层析可得到纯品;在高温(37 ℃)培养表达时,CH82主要以包涵体形式出现,经尿素变性与复性处理后,可通过Heparin-agarose亲和层析得到纯品. 所得纯品均具有结合肝素和结合细胞的功能,且结合细胞的能力比双结构域FN更强,表明两个结合细胞的功能结构域均有活性.
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重组FN多肽CH50及IFN-γ对化疗小鼠免疫功能影响的比较
腹腔连续注射CH50或腹腔内转染IFN-γ基因能减弱或防止化疗药物对免疫功能的抑制作用,减轻或防止化疗药物使外周血单核细胞数量和腹腔细胞的数量降低(P＜0.05),促进巨噬细胞代谢活性、杀瘤活性以及分泌细胞因子的能力(P＜0.05, ＜0.01);促进脾淋巴细胞的增殖反应能力(P＜0.05,＜0.01).注射CH50的作用早于IFN-γ基因转染的作用.结果提示CH50可改善肿瘤化疗药物疗效.
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免疫抑制蝎毒活性肽Im169的重组表达和功能鉴定
目的:筛选鉴定新型蝎毒免疫活性肽.方法:从海南斑等蝎(Isometrus maculates)毒腺组织cDNA文库中筛选和分离蝎毒肽基因,通过GST融合蛋白表达纯化、肠激酶酶切和高压液相色谱(HPLC)分离的方法,获得色谱纯重组蝎毒活性肽,酶联免疫吸附(ELISA)实验检测细胞因子,鉴定免疫调节活性.结果:筛选得到一个新的蝎毒活性肽基因Im169,其编码的成熟肽由29个氨基酸组成,其中含有6个半胱氨酸.Im169多肽对T淋巴细胞IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的分泌具有明显的抑制作用,且作用呈浓度依赖性(P＜0.05).序列分析显示:Im169多肽和蝎钾通道毒素的相似性高,提示其是一个潜在的钾通道毒素多肽.功能机制分析显示:Im169多肽通过抑制T细胞表面的钾通道,从而发挥免疫抑制功能.结论:发现了一个新的蝎毒免疫调节肽,丰富了对蝎毒活性肽的功能认识,为自身免疫疾病的药物开发提供了新的多肽模板.
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生物制药治疗肺部疾病前景看好
随着生物技术与基因工程的快速发展,治疗学领域提出了生物药物(biologic agents)的概念.生物药物可分为:生化药物、生物制品、微生物药物及生物技术药物四大类.有些难以成规模化生产的微量生命活性物质,经分离纯化研究确认其结构、药效后,利用生物技术方法进行规模化生产,统称为生物技术药物,如基因重组技术、蛋白质工程获得的在医药领域应用的产品,如基因重组多肽、蛋白质类药物、基因疫苗、反义核酸药物等,本文中所述的生物药物实际上是生物技术药物的简称.
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重组大鼠溶菌酶N端多肽的原核表达及其对晚期糖基化终产物的结合作用
目的:探讨溶菌酶N端多肽片段基因的重组并在原核中表达,研究该片段与晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的结合作用.方法:从SD大鼠外周血白细胞中抽提总RNA,经逆转录并扩增大鼠溶菌酶N端基因片段,以质粒pET-30a(+)为载体构建表达质粒pLY77.含pLY77的工程菌Rosetta(DE3)经IPTG诱导,对该重组多肽进行高效表达.表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化后,得到的溶菌酶N端多肽片段LY77经SDS-PAGE和Western印迹法鉴定,ELISA法分析体外结合活性.结果:LY77在Rosetta(DE3)中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,相对分子质量约为11 000;LY77对体外制备的晚期糖基化蛋白BSA-AGEs具有显著的结合活性.结论:LY77对AGEs具有很高的亲和力,为进一步探讨LY77可能应用于体内促进AGEs的清除和参与免疫调节作用奠定基础.
关键词： 溶菌酶 原核表达 重组多肽 晚期糖基化终产物(AGEs) -
DNA疫苗与脂质体
DNA疫苗(DNA vaccine)亦称是基因疫苗、核酸疫苗,是携带编码外源抗原的真核细胞重组表达质粒即质粒DNA,用其接种动物能在宿主细胞表达外源抗原,可引起免疫反应(包括体液免疫和细胞免疫)而提供保护作用,是继灭活疫苗、减毒活疫苗、重组多肽亚单位疫苗之后的新一代疫苗.
