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miR-495在骨肉瘤细胞中表达变化、对MG-63细胞增殖的影响及其机制
目的 观察miR-495在骨肉瘤细胞中的表达变化及其对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响,并探讨可能的分子机制.方法 采用real-time PCR法检测人骨肉瘤细胞系Saos-2、U20S、MG-63及人成骨细胞hFOB1.19中的miR-495.将MG-63细胞分为阴性对照组、miR-495 mimics组、miR-495 mimics+HMGA2组,分别转染mimics-NC、miR-495 mimics、miR-495 mimics+HMGA2表达质粒,转染24、48、72、96 h后,采用CCK-8法检测MG-63细胞增殖能力.应用靶基因在线预测数据库miRanda并结合基因的功能分析进行miR-495的靶基因预测.采用双荧光素酶报告实验验证miR-495与靶基因的结合位点.采用Western blotting法验证miR-495对高迁移率族蛋白A2(HMGA2)表达的靶向调控作用.结果 Saos-2、MG-63、U20S细胞中miR-495的相对表达量低于hFOB1.19细胞(P均<0.01).转染48、72、96 h后miR-495 mimics组MG-63细胞OD值低于阴性对照组组,miR-495 mimics+HMGA2组MG-63细胞OD值高于miR-495 mimics组(P均<0.01).双荧光素酶报告实验结果提示miR-495可与HMGA2的3′UTR区特异性结合,从而显著抑制荧光素酶活性.miR-495 mimics组MG-63细胞中HMGA2蛋白的相对表达量低于mimics-NC组,miR-495 mimics+HMGA2组MG-63细胞中HMGA2蛋白的相对表达量高于miR-495 mimics组(P均<0.01).结论 骨肉瘤细胞中miR-495的表达水平低于正常成骨细胞;上调miR-495表达后骨肉瘤细胞增殖受到抑制;miR-495可能通过靶向调控HMGA2表达从而抑制骨肉瘤细胞的增殖.
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转染miR-143的骨肉瘤细胞MG-63增殖能力、周期分布观察
目的 观察转染miR-143的骨肉瘤细胞MG-63增殖能力、周期分布情况,并探讨其机制.方法 将骨肉瘤MG-63细胞分为实验组、阴性对照组和空白组.实验组转染miR-143序列,阴性对照组转染阴性对照NC序列,空白对照组加入PBS.转染24 h后收集各组细胞,分别于12、24、48、72 h后采用MTT法检测细胞增殖能力.转染24 h后采用流式细胞仪分析各组不同周期细胞比例.采用RT-PCR法检测各组细胞中的Bcl-2 mRNA,采用Western blotting法检测Bcl-2蛋白.结果 实验组转染后24、48、72 h细胞增殖能力低于空白组和阴性对照组(P均<0.05).实验组G0/G1期细胞比例高于空白组和阴性对照组,S期、G2/M期细胞比例低于空白组和阴性对照组(P均<0.05).实验组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量均低于空白组和阴性对照组(P均<0.05).结论 转染miR-143的骨肉瘤MG-63细胞增殖受到抑制,细胞周期阻滞(G0/G1期细胞比例增高,S期、G2/M期细胞比例降低),上述变化可能与Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调有关.
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白花丹素对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制
目的 探讨白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63(简称骨肉瘤细胞)增殖、凋亡的影响,并探讨其可能的机制.方法 将对数生长期的骨肉瘤细胞随机分为四组,5 μmol/L组、10 μmol/L组和20 μmol/L组分别加入含5、10和20 μmol/L白花丹素的培养基,正常对照组加入含0.1% DMSO的完全培养基.培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Hoechst33342染色后计算细胞凋亡率,流式细胞术检测活性氧(ROS)水平,Western blotting法检测Bcl-2、Bax蛋白相对表达量.结果 对照组、5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组细胞增殖抑制率和凋亡率均逐渐升高,组间两两比较P均<0.05.对照组和5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组ROS水平、Bax蛋白相对表达量均逐渐升高,Bcl-2蛋白相对表达量逐渐降低,组间比较P均<0.05.结论 白花丹素能够抑制骨肉瘤细胞增殖、促进其凋亡,并呈浓度依赖性;升高细胞内ROS水平、激活线粒体途径可能是其作用机制.
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HSP70及 Ezrin 蛋白表达变化对人成骨肉瘤M G63细胞凋亡和增殖的影响
目的：分析人成骨肉瘤MG63细胞中热休克蛋白70（ HSP70）、细胞骨架蛋白（ Ezrin）的表达对该细胞凋亡和增殖的影响。方法首先在有双启动子的质粒载体pGFP-V-RS中构建能够表达HSP70和Ezrin蛋白shRNA的载体并重组质粒，将质粒转染入MG63细胞，分为联合表达组、单纯shRNA组、空白载体组，筛选稳定表达细胞培养增殖，采用RT-PCR及Western blotting法检测这两种蛋白基因表达情况与蛋白水平；Western blotting法检测凋亡相关蛋白，使用流式细胞术及噻唑蓝比色法分别检测第1、3、5、7天细胞凋亡及增殖率。结果联合表达组Ezrin mRNA及Ezrin蛋白合成量低于空白载体组和单纯shRNA组，HSP70 mRNA及HSP70蛋白合成量高于空白载体组和单纯shRNA组（ P均＜0．01），HSP70和Ezrin联合表达的MG63细胞构建成功。低表达Ezrin和高表达HSP70的载体质粒构建成功。联合表达组MG63细胞凋亡率（23．94％±0．48％）较空白载体组（10．96％±0．25％）高（ P＜0．01），增殖速度（308．67％±2．91％）较单纯shRNA组（394．80％±2．63％）慢（P＜0．01）；与空白载体组比较，单纯shRNA组、联合表达组第3、5、7天细胞增殖率降低，抑制率升高（ P均＜0．01）。与单纯shRNA组比较，联合表达组第3、5、7天细胞增殖率低，抑制率低（P均＜0．01）。结论高表达的HSP70和低表达的Ezrin在促进骨肉瘤细胞凋亡的同时减缓其增长速度。
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苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究
目的:探讨苦参碱对人骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.方法:将不同浓度的苦参碱作用于培养的OS732骨肉瘤细胞,通过MTT比色法、流式细胞仪和DNA凝胶电泳、电子显微镜技术观察检测细胞凋亡,研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.结果:苦参碱浓度为0.5、1.0、1.5g/l时,细胞毒性指数分别为12.1%、21.6%、39.5%;流式细胞术示骨肉瘤细胞的凋亡率分别为9.8%、16.9%、25.5%;DNA电泳见DNA"梯形"图谱;电镜显示细胞的凋亡形态.结论:苦参碱能显著抑制OS732细胞增殖、促进其凋亡.
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LncRNA MEG3对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响
目的:探讨LncRNA MEG3(MEG3)对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法:构建pcDNA3.0-MEG3重组质粒.qRT-PCR法检测MEG3在人正常成骨细胞hFOB1.19,转染pcDNA3.0-MEG3前后人骨肉瘤细胞系MG63、U-2 OS中的表达,以转染空质粒和未转染的骨肉瘤细胞作对照.采用CCK-8法检测转染空质粒和pcD-NA 3.0-MEG3的MG63、U-2 OS细胞的增殖能力,采用Transwell迁移实验和流式细胞术分别检测细胞迁移能力和细胞凋亡.结果:与正常成骨细胞相比,MEG3在骨肉瘤细胞中的表达降低(P＜0.05).转染pcDNA3.0-MEG3重组质粒后MG63和U-2 OS细胞的增殖和侵袭能力减弱,凋亡增强(P＜0.05).结论:MEG3在骨肉瘤细胞中低表达;MEG3过表达可抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭,促进凋亡.
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顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞株作用的分子机制
目的 探讨顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞(MG-63)作用的分子机制.方法 骨肉瘤细胞混悬液与不同浓度顺铂和卡铂分别作用24、48、72 h后,用倒置显微镜观察细胞生长情况.用噻唑蓝法测定每孔的吸光度值,制作生长曲线,并求出顺铂和卡铂的半抑制浓度(IC50).用IC50顺铂、卡铂作用于骨肉瘤细胞24、48、72 h后用流式细胞仪进行细胞周期分析.免疫印迹技术观察细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Bax的表达.结果 相同浓度顺铂和卡铂作用的骨肉瘤细胞死亡数量随时间增加而增加.不同浓度顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞分别作用24、48、72 h后,对细胞的生长均起到抑制作用,相同时间内,药物浓度越高,生长抑制作用越明显(P＜0.05).骨肉瘤细胞与IC50顺铂和卡铂作用24、48、72 h后,在细胞各期均未见明显凋亡峰,但随着时间增加,G1、S、G2期所占比例逐渐下降;顺铂和卡铂作用后不同时间点凋亡细胞所占比例比较差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,顺铂组和卡铂组PCNA表达下降,Bax表达增加,Bcl-2表达略减少.结论 顺铂和卡铂对肿瘤细胞生长各期均有抑制作用,对于骨肉瘤细胞来说,卡铂的浓度约需25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应.顺铂、卡铂与骨肉瘤细胞作用后存在凋亡现象,但是未能形成凋亡峰,这可能与铂类化合物能够对处于任何生长周期的细胞均能产生杀伤作用有关.
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氧化苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究
目的 探讨不同浓度的氧化苦参碱对人骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.方法 将不同浓度的氧化苦参碱作用于培养的OS732骨肉瘤细胞,通过MTT比色法、流式细胞仪和DNA凝胶电泳、光学显微镜技术观察检测细胞凋亡,研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.结果 浓度为1177,3.55,5.32mmoL/L的氧化苦参碱对OS732骨肉瘤细胞相对抑制率分别为16.4%,29.0%,47.0%;流式细胞技术显示骨肉瘤细胞的凋亡率分别为11.8%,18.6%,27.7%;DNA电泳见DNA"梯形"图谱;显微镜显示细胞的凋亡形态.结论 氧化苦参碱能显著抑制OS732细胞增殖、促进其凋亡.
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华蟾素诱导骨肉瘤细胞凋亡及其机制
目的:探讨华蟾素诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的效果及其可能机制.方法:体外培养人骨肉瘤细胞系U2OS,将其分为第1,2,3,4,5组,于其培养基内分别加入0,0.5,1.0,1.5,2.0 μg/mL华蟾素,每组分别于培养的第24,48,72 h进行检测.MTT法检测各组骨肉瘤细胞生长的抑制率,TUNEI染色观察第4组细胞凋亡程度并计算其凋亡率,免疫荧光染色检测第4组凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的含量并计算其比值,RT-PCR检测Bax和Bcl-2的表达.结果:MTT试验显示,随着各组华蟾素浓度的增加,细胞生长抑制率明显增加,其中第5组48 h生长抑制率增加至(59.56±1.95)％,相当于第2组同期(22.85±1.34)％的2.5倍(P＜0.01).随着培养时间的延长,各组细胞生长抑制均有不同程度的增加,以第5组72 h为显著.Tunel染色显示,随着华蟾素干预时间的延长,U20S细胞凋亡率显著上升,与华蟾素作用于细胞24,48时相比,作用72 h后凋亡率达到(32.35±1.57)％,凋亡率明显增加(P＜0.01).免疫荧光和RT-PCR提示,随着华蟾素作用时间的延长,第4组Bax的表达逐渐增加,而Bcl-2的表达逐渐减少,同时Bax/Bcl-2含量的比值也逐渐增加.结论:华蟾素具有抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖和诱导其凋亡的作用,其疗效呈剂量和时间依赖性,而其机制可能与华蟾素影响Bax和Bcl-2的表达有关.华蟾素具有治疗骨肉瘤的潜力,值得进一步研究探讨.
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TRAIL联合阿霉素和IFN-γ对人骨肉瘤细胞TRAIL相关受体的影响
目的:探讨TRAIL联合阿霉素和IFN-γ对人骨肉瘤细胞凋亡的作用及可能机制.方法:采用MTT法检测不同浓度及不同时间下TRAIL的抗癌活性.用流式细胞仪检测TRAIL、阿霉素和IFN-γ单独及联合应用后人骨肉瘤MG-63的凋亡率.RT-PCR法检测DR5及Yin Yang1 (YY1) mRNA在加药前后的表达.结果:TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联合作用于MG-63细胞后,能显著增强对MG-63的杀伤、抑制增殖及诱导凋亡作用,明显高于单独应用TRAIL组或阿霉素组(P＜0.05).结论:TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联用能显著提高骨肉瘤细胞MG-63生长抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与DR5 mRNA表达上调及Yin Yang1 (YY1) mRNA表达被抑制有关.
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TRAIL联合顺铂和IFN-γ对人骨肉瘤细胞凋亡的影响
目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合顺铂和IFN-γ应用对人骨肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡的作用.方法:用MTT测定TRAIL、顺铂、IFN-γ单独或联合应用对人骨肉瘤细胞MG-63的体外增殖抑制作用,并检测各组细胞凋亡率.结果:TRAIL、顺铂、IFN-γ三者联合作用于MG-63细胞后,能显著增强对MG-63的杀伤、抑制增殖及诱导凋亡作用,明显高于单独应用TRAIL组或顺铂组(P＜0.05).结论:TRAIL、顺铂、IFN-γ三者联用能显著提高骨肉瘤细胞MG-63生长抑制和诱导凋亡作用.
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50Hz正弦电磁场对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响
目的 探讨50 Hz、1.0 mT正弦电磁场对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响.方法 将骨肉瘤MG-63细胞分成对照组和实验组,对照组放在无电磁场的培养箱中,实验组放入含有50 Hz、1.0 mT正弦电磁场的培养箱中,分别在第2天、第4天和第6天采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖活性,流式细胞仪测定细胞周期,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测cyclin B1和cyclin D1的mRNA表达水平变化.结果 2组比较,实验组细胞增殖活性明显降低、G0-G1期细胞数目增多、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表达水平F降.结论 50 Hz、1.0 mT正弦电磁场能够显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.
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干扰素应答因子1对不同p53状态骨肉瘤凋亡的调节作用
目的 观察干扰素应答因子1(IRF-1)基因对不同p53状态骨肉瘤细胞凋亡的调节作用,并探讨其机制.方法 利用U2OS(p53+/+)和Saos2(p53-/-)骨肉瘤细胞作为研究模型,用不同剂量阿霉素处理后,Western blot检测IRF-1表达的变化.进一步通过过表达IRF-1基因或敲除IRF-1基因,检测其对骨肉瘤细胞凋亡的影响.并通过实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测IRF-1对p53下游靶基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)和p21的调节作用.结果 不同剂量阿霉素处理U2OS和Saos2后,Western blot结果显示IRF-1的表达明显增高.进一步过表达IRF-1后,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞死亡率明显增高(P＜0.05);干涉IRF-1基因后,全量LDH检测细胞死亡率则明显降低(P＜0.05).RT-qPCR检测显示,IRF-1对p53下游靶基因bax和p21在p53-/-SaOS-2细胞中具有明显的促进作用(P＜0.05),而对于p53+/+U2OS中的作用并不明显(P＞0.05).结论 IRF-1可通过调节p53下游靶基因bax和p21的表达,从而显著促进阿霉素诱导的骨肉瘤细胞凋亡.
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白花丹素对骨肉瘤细胞系U2OS的作用及其机制
目的 研究白花丹素对骨肉瘤细胞系U2OS的作用,并初步探讨其作用机制.方法 用CCK-8法检测白花丹素对骨肉瘤细胞的促凋亡作用；用HOECHST 33342染色研究白花丹素对骨肉瘤细胞作用后的形态学变化；用Western blot法检测白花丹素作用后骨肉瘤细胞MDM2和p53蛋白表达情况.结果 CCK-8结果显示白花丹素对骨肉瘤细胞有明显的抑制作用,而且呈浓度依赖性；HOECHST33342染色结果显示白花丹素对骨肉瘤U2OS细胞的抑制作用主要是通过促进凋亡来实现；Western blot结果显示白花丹素能够改变p53/MDM2基因表达比例.结论 白花丹素通过细胞凋亡途径抑制骨肉瘤细胞系U2OS细胞的生长.
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TRAIL联合阿霉素和IFN-γ对人骨肉瘤细胞凋亡的影响
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合阿霉素和IFN-γ应用对人骨肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡的作用.方法 用MTT测定TRAIL、阿霉素、IFN-γ单独或联合应用对人骨肉瘤细胞MG-63的体外增殖抑制作用,并检测各组细胞凋亡率.结果 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联合作用于MG-63细胞后,能显著增强对MG-63的杀伤、抑制增殖及诱导凋亡作用.明显高于单独应用TRAIL组或阿霉素组(P＜0.05).结论 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联用能显著提高骨肉瘤细胞MG-63生长抑制和诱导凋亡作用.
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氧化苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究
目的:探讨不同浓度的氧化苦参碱对人骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.方法:将不同浓度的氧化苦参碱作用于培养的OS732骨肉瘤细胞,通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪和DNA凝胶电泳、光学显微镜技术观察检测细胞凋亡,研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.结果:浓度为1.77,3.55,5.32 mmoL·L-1的氧化苦参碱对OS732骨肉瘤细胞相对抑制率分别为16.4%,29.0%,47.0%;流式细胞技术显示骨肉瘤细胞的凋亡率分别为11.8%,18.6%,27.7%;DNA电泳见DNA"梯形"图谱;显微镜显示细胞的凋亡形态.结论:氧化苦参碱能显著抑制OS732细胞增殖、促进其凋亡.
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富勒烯(C60)-甘氨酸衍生物对小鼠骨肉瘤细胞生长的影响
目的 研究富勒烯(C60)-甘氨酸衍生物在光照条件下对体外培养的小鼠骨肉瘤细胞生长的影响,探讨其作用机制.方法 将不同浓度C60-甘氨酸与小鼠骨肉瘤细胞混合培养,用流式细胞仪检测C60-甘氨酸在光照条件下对小鼠骨肉瘤细胞的致坏死率.同时光照后检测产生的超氧阴离子自由基、超氧化物歧化酶(SOD)值的改变.结果 随着C60-甘氨酸浓度增大,骨肉瘤细胞的坏死率增大,同时导致超氧阴离子自由基升高,SOD含量下降.结论 C60-甘氨酸在光照条件下对小鼠骨肉瘤细胞有较强的杀伤作用,作用机制与自由基的产生有关.
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青蒿琥酯与大蒜素在体外对骨肉瘤细胞株的协同抗癌作用
目的:探讨青蒿琥酯和大蒜素联合作用对人骨肉瘤细胞株MG-63、U20S的体外抑制效果.方法:分别采用25、50、100μmol/L的大蒜素,10、20、40μmol/L的青蒿琥酯分别作用于体外培养的人骨肉瘤细胞株MG-63、U20S于24h.在显微镜下观察肿瘤细胞的凋亡情况,并采取MTT法检测实际的肿瘤抑制效果.以两者联合应用作为对照作用于人骨肉瘤细胞株MG-63、U20S,比较单独用药和联合用药的差异.结果:青蒿琥酯与大蒜素联合应用,对人骨肉瘤细胞株MG-63、U20S增殖有较好的抑制作用,并诱导其凋亡,较单独使用其中一种药物而言,联合用药效果更佳,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:青蒿琥酯与大蒜素在体外对骨肉瘤细胞株的抗癌作用具有协同效应,且两者的作用机理不同,值得深入研究.
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MiR-181a靶向RASSF1A促进骨肉瘤细胞的生长和转移
目的:探讨miR-181a是否靶向调控抑癌基因RAS相关区域家族1A(Ras-association domain family 1,isoform A,RASSF1A),从而促进骨肉瘤细胞的生长和转移.方法:采用real-time PCR检测30例人骨肉瘤组织及其癌旁正常骨组织中miR-181a的表达,并分析miR-181a表达水平与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性.在骨肉瘤细胞MG-63中瞬时转染miR-181a模拟物和miR-181a抑制剂,分别采用MTT和transwell检测miR-181a对骨肉瘤细胞生长和转移的作用.随后,预测并通过双荧光素酶报告基因验证miR-181a与RASSF1A基因3＇-非编码区(3＇-untranslated region,3＇-UTR)的特异性结合作用.结果:与癌旁正常骨组织比较,miR-181a在骨肉瘤组织中高表达(P＜0.001),但其表达水平与骨肉瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤病理分期等无明显相关性(P＞0.05).MTT及transwell结果显示过表达miR-181a促进了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著高于阴性对照组(P＜0.05);而抑制miR-181a的表达降低了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著低于阴性对照组(P＜0.05).双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-181a可靶向结合RASSF1A基因3＇-UTR,从而调控RASSF 1A的表达.结论:miR-181a可特异性结合RASSF1A基因3＇-UTR,下调RASSF1A基因的表达,从而促进人骨肉瘤细胞MG-63的生长和转移.
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磷酸钙骨水泥/顺铂复合体体外药物缓释及体内抑瘤和修复骨缺损的实验研究
目的:寻找磷酸钙骨水泥/顺铂复合体修复肿瘤性骨缺损的佳质量构成比.方法:通过原子吸收分光光度法对通过混合-模压法制备的不同质量比构成的磷酸钙骨水泥/顺铂复合体体外缓释液中顺铂浓度进行测定,寻找合适的磷酸钙骨水泥、顺铂质量构成比,在此基础上制备骨缺损和移植肿瘤动物模型和动物体内进行骨缺损的修复实验和体内抑瘤实验.结果:含0.1%～0.2%顺铂的磷酸钙骨水泥能够修复兔骨缺损,同时又能对肿瘤细胞产生抑制杀伤作用.结论:含0.1%～0.2%顺铂的磷酸钙骨水泥能够消灭残存肿瘤细胞,且终不影响骨修复的进程.
