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载脂蛋白H在肾小管疾病中的研究进展
载脂蛋白H,系人血浆中的一种由326 个氨基酸残基组成的单链糖蛋白,包括5个相似的结构域,其中富含脯氨酸和半胱氨酸.其理化特性及编码基因特点都己陆续阐明.能激活脂蛋白酯酶,从而参与脂类代谢,作用于凝血机制,抑制血凝,其检测是反映肾小管病变的又一良好指标.
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抗磷脂抗体靶抗原-β2糖蛋白Ⅰ的原核表达和鉴定
目的构建β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)的原核表达载体并诱导其表达.方法利用PCR技术从β2-GPI昆虫表达载体中扩增出编码β2-GPI目的DNA片段,将其插入GST融合表达载体pGEX-2T多克隆位点,以IPTG诱导GST融合β2-GPI的表达.结果凝胶电泳显示昆虫表达载体的PCR扩增产物的分子量大小与目的片段大小相符.对重组质粒(pGEX-2T-β2-GPI)分析表明,插入片段的序列与发表的β2-GPI基因编码序列一致.在IPTG的诱导下,BL21重组菌高效表达出一个分子量约为64kDa产物,与预期相符.结论β2-GPI编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T.
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β2糖蛋白Ⅰ与重组乙型肝炎表面抗原的结合特性
目的研究HBsAg与β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)的结合特性,探讨β2GPⅠ参与HBV感染的机制. 方法采用酶联免疫吸附实验,研究标记的人β2GPⅠ与重组HBsAg的结合特性. 结果标记的人β2GPⅠ与HBsAg有高度亲和力,并可以被过量的未标记人β2GPⅠ所抑制. 结论β2GPⅠ与HBsAg的结合特性可能是β2GPⅠ介导乙肝病毒感染肝细胞的结构基础.
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Toll样受体4增强β2糖蛋白1免疫小鼠B细胞的活化
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)在β2糖蛋白Ⅰ(β2GP1)免疫的小鼠中,对B细胞活化过程的影响.方法 将C3H/HeN(TLR4正常型)和C3 H/HeJ(TLR4缺陷型)2种小鼠随机分为β2GP1免疫组和生理盐水对照组,分别注射β2GP1或等量的生理盐水进行免疫.采用皮下多点注射进行初次免疫,2次腹腔注射加强免疫,后冲击免疫的方法免疫小鼠.采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GP1抗体的效价;HE染色观察小鼠脾脏生发中心数量及大小的变化;免疫组织化学法观察脾脏生发中心内的CD40配体(CD40L)表达;流式细胞术检测小鼠脾脏B淋巴细胞中共刺激分子CD80和CD86的水平变化.结果 经β2GP1免疫后,2种小鼠血清中均出现高效价的抗β2GP1抗体,且C3H/HeN血清效价高于C3H/HeJ小鼠.与生理盐水对照组相比,2种小鼠经β2GP1刺激后,CD40L、CD19+ CD80+细胞和CD19+ CD86+细胞的数量均显著增加;但C3H/HeJ小鼠CD40L,CD19+ CD80+细胞和CD19+ CD86+细胞的数量低于C3H/HeN小鼠.经β2GP1刺激的小鼠脾脏生发中心,比生理盐水组更大更多,C3H/HeN小鼠的生发中心的数量多于C3H/HeJ小鼠.结论 TLR4增强β2GP1免疫小鼠B细胞的活化.
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β2糖蛋白Ⅰ免疫小鼠对辅助性T细胞亚群分化的影响
目的 探讨β2糖蛋白Ⅰ(β2 GPI)免疫小鼠引起的辅助性T(Th)细胞分化和抗β2GPI抗体产生的机制.方法 将健康的BALB/c小鼠随机分为生理盐水组和β2GPI免疫组,每隔2周由尾静脉注射β2GPI或等量生理盐水,共注射2次或4次.采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GPI抗体的效价;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脾脏细胞GATA结合蛋白3(GATA3)、白细胞介素4(IL-4)、表达于T细胞的T盒(T-bet)、γ干扰素(IFN-γ)、Foxp3的mRNA水平;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中GATA3阳性细胞和Foxp3阳性细胞的比例.结果 2次免疫后,小鼠血清中出现高效价(1∶100 000)的抗β2GPI抗体,脾脏中Th2特异性指标GATA3、IL-4的mRNA水平和GATA3阳性细胞比例相对生理盐水组升高.4次免疫后,小鼠血清中抗β2GPI抗体效价进一步升高(＞1∶100 000),脾脏GATA3、Th1细胞特异性标志物(T-bet、IFN-γ)和调节性T细胞特异性标志Foxp3的mRNA水平下调,IL-4的mRNA水平和2次免疫后无明显差异.此外,脾脏细胞中GATA3阳性细胞的比例进一步上调且伴有Foxp3阳性细胞比例的下调.结论 β2GPI免疫小鼠引起Th细胞向Th2细胞优势分化,并伴有Th1细胞和调节性T细胞的抑制,有利于抗β2GPI抗体的产生.
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β2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用
目的 利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性.方法 应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35 ～51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性.体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3 H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF) mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/HeN小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT).结果 化学合成β2GP1多肽的纯度为94％,达到免疫用抗原标准.偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000.Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合.体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达.体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短.结论 所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应.
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协同因子β2-GPI的分离、纯化和鉴定
目的进一步研究β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)、心磷脂(CL)和抗心磷脂抗体(aCL)三者之间的关系,以及β2-GPI在aCL致血栓形成中所起的作用,从人血清中提纯β2-GPI.方法采用高氯酸沉淀血清中的杂蛋白,过DEAE纤维素层析柱和DEAE Sephadex A-50层析柱.结果经SDS-PAGE测定纯化样品的分子量为50 KD;经皮免疫小鼠后,小鼠血清中可检测到高滴度的aCL.结论上述组合方法方便可行,为β2-GPI的进一步研究奠定了良好的基础.
