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口山酮抑制ox-LDL诱导的内皮细胞组织因子表达及机制研究
[目的]研究口山酮化合物去甲基雏菊叶龙胆酮(DMB)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的内皮细胞组织因子(TF)表达的影响及机制.[方法]培养人脐静脉内皮细胞,加入ox-LDL(0.2 mg/mL)孵育24 h诱导TF表达,一期凝固法和反转录PCR分别检测TF的活性和mRNA表达,用荧光试剂H2DCF-DA检测细胞内活性氧(ROS)的水平,EMSA检测核因子(NF)-KB活性.[结果]孵育ox-LDL(0.2 mg/mL)24 h能显著增加内皮细胞TF的活性和上调其mRNA表达,同时增加细胞内ROS生成和激活NF-kB.在加入ox-LDL前1 h分别加入1、3或10/μmol/L DMB能呈浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的TF活性和mRNA水平的增加.而且,DMB能显著降低ox-LDL诱导的细胞内ROS的生成增加和NF-kB的激活.[结论]DMB能抑制ox-LDL诱导的内皮细胞TF表达,其作用与抑制细胞内ROS生成和NF-KB激活有关.
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有机阴离子转运蛋白1在人血管平滑肌细胞表达的意义
[目的]检测有机阴离子转运蛋白1(OAT1) mRNA和蛋白质在人血管平滑肌细胞的表达以及尿酸刺激对其表达的影响.[方法]分离培养人脐动脉血管平滑肌细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR方法扩增特异性OAT1 cDNA片断,制备探针,用Northern blot方法检测OAT1 mRNA的表达,提取细胞膜蛋白和总蛋白,用Western blot方法检测OAT1的蛋白表达;用800 μmol/L的尿酸刺激细胞,观察OAT1的表达变化.[结果]从人血管平滑肌细胞检测到OAT1 mRNA和蛋白的表达.尿酸可以明显增强OAT1的表达.[结论]人血管平滑肌细胞有明确的OAT1表达,OAT1可能部分介导了血管平滑肌细胞对尿酸的摄取过程.
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ATP对LPS诱导人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响及其机制
[目的]观察不同浓度三磷酸腺苷(ATP)对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达相关炎症因子的影响,并探讨其可能机制.[方法]采用RT-PCR检测不同浓度ATP对LPS(1 mg/mL)诱导HUVECs表达炎症细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响,进一步采用RT-PCR检测靶浓度的ATP对HUVECs表达TLR受体及TLR4辅助分子CD14和MyD88的mRNA水平的影响.[结果]经1mg/mL的LPS干预处理后,IL-1β、MCP-1和ICAM-1在HUVECs中的mRNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P＜0.01);ATP在低浓度(1μmol/L、10μmol/L)时可显著下调LPS诱导的IL-1β、MCP-1和ICAM-1的mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P＜0.01).ATP在10 μmol/L浓度时显著下调TLR4、TLR3 mRNA表达水平,并可显著下调TLR4调节蛋白CD14和MyD88 mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P＜0.01).[结论]低浓度的ATP可能通过负性调节TLR4信号通路而抑制LPS诱导的炎症细胞因子在HUVECs中的表达,有望为临床上动脉粥样硬化等炎症性疾病的治疗提供一条新的途径.
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血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
目的 观察血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响.方法 采用胰蛋白酶消化法原代培养HUVECs,取2～5代用于实验,培养的HUVECs随机分为:对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)+A-779组,用吖啶橙(AO)/溴乙锭(BE)法观察细胞凋亡的形态学变化,用流式细胞术检测内皮细胞的凋亡率.结果 (1)AngⅡ(10-6 mol/L)可以诱导HUVECs凋亡率明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(25.60%±3.17% vs 2.32%±0.24%,P＜0.005);不同浓度的Ang-(1-7)(10-9～10-6 mol/L)呈剂量依赖性抑制AngⅡ所诱导的内皮细胞的凋亡,与AngⅡ组相比差异有统计学意义(20.04%±2.21%,16.04%±1.32%,10.04%±2.05%,7.79%±1.50%,P＜0.05);力Ⅱ用Ang-(1-7)特异性受体拮抗剂A-779可阻断Ang-(1-7)的上述效应,与AngⅡ+Ang-(1-7)组比较差异有统计学意义(23.37%±0.75%vs 20.04%±2.21%,16.04%±1.32%,10.04%±2.05%,7.79%±1.50%,P＜0.05).结论 AngⅡ可诱导内皮细胞凋亡增加,Ang-(1-7)呈浓度依赖性抑制AngⅡ的上述效应,并且是通过其特异性受体Mas发挥作用.
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gax基因与血管平滑肌细胞增殖
gax基因是一个主要存在于心血管系统的同源盒基因,能显著抑制血管平滑肌细胞增殖,有望成为防治动脉粥样硬化和经皮血管介入治疗后再狭窄的靶基因.
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妊娠期肝内胆汁淤积症患者血管内皮祖细胞生物学变化特点分析
目的：分析妊娠期肝内胆汁淤积症患者血管内皮祖细胞（EPC）生物学变化特点，并了解其变化所代表的意义。方法选取该院2012年3月至2013年3月收治的妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇30例作为观察组；另选取同期在该院检查的健康妊娠期孕妇30例作为对照组，对两组孕妇的EPC生物学特点进行比较。结果观察组孕妇的血清胆汁酸水平高于对照组，EPC数量比、增殖OD值、迁移数、黏附数低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇的EPC功能功能下降，其与胆汁酸对细胞膜造成的破坏作用有密切关系。
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内皮祖细胞在治疗性血管新生中的作用及应用潜能研究进展
静脉血栓的溶解、机化过程与伤口愈合过程类似[1].血栓机化初期,血栓内可观察到炎症细胞的浸润和新生内皮细胞(ECs)被覆的管腔结构,这与肉芽组织中毛细血管形成过程相似,说明血栓溶解过程中伴随有新生血管的形成.有研究表明,白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和血管内皮生长因子165(VEGF165)等促血管新生因子均可通过诱导血管新生作用加速血栓溶解、机化和再通[2].
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金钠多对体外缺氧致人大动脉内皮细胞分泌内皮素的影响
目的:探讨不同浓度金钠多对由缺氧所致培养的血管内皮细胞分泌内皮素功能的影响.方法:将培养的血管内皮细胞分为空白对照组、单纯缺氧组、缺氧加高浓度金钠多组、缺氧加中浓度金钠多组和缺氧加低浓度金钠多组.采用低压舱上升至5000 m高度、停留30 min,对培养的血管内皮细胞进行缺氧.用放射免疫法测定缺氧前和缺氧后0.5, 6, 24 h各组细胞培养液中内皮素含量.结果:①急性缺氧可显著促进血管内皮细胞分泌内皮素,缺氧后0.5 h内皮素含量即显著升高,于缺氧后6h分泌内皮素含量高.②金钠多能明显抑制缺氧促血管内皮细胞分泌内皮素的作用,在缺氧后0.5 h表现出高浓度金钠多强于中浓度和低浓度金钠多组,在缺氧后6和24 h则中浓度金钠多的作用要强于高浓度和低浓度组.结论:金钠多能显著抑制缺氧促血管内皮细胞分泌内皮素的作用,且中浓度金钠多较高浓度和低浓度金钠多作用更明显.
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MAPK在葡萄糖及AngⅡ致血管平滑肌细胞增殖反应中的作用
目的: 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在葡萄糖(GS)和/或血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导大鼠动脉平滑肌细胞促增殖中的作用及其可能的调控机制. 方法: 实验以平滑肌细胞蛋白合成速率和蛋白含量为平滑肌细胞增殖的指标,以平滑肌细胞3H-亮氨酸掺入率表示细胞蛋白质合成速率,通过3H-胸苷(3H-TdR)反映平滑肌细胞DNA的代谢及细胞增殖情况;并通过给予PD098059及高浓度葡萄糖(HG)预处理,观察它们对细胞蛋白合成、DNA代谢及细胞增殖的影响. 结果: ① AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞,3H-胸苷掺入率明显增高;HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞,3H-胸苷掺入率明显增高;AngⅡ+HG处理平滑肌细胞3H-胸苷掺入率显著增高. ② AngⅡ增加3H-胸苷掺入的作用可明显被PD098059所抑制;AngⅡ+HG增高3H-胸苷掺入的作用也可被PD098059所抑制. ③ AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞,3H-亮氨酸掺入率明显增高;HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞,3H-亮氨酸掺入率增加;AngⅡ+HG处理平滑肌细胞3H-亮氨酸掺入率显著增加. ④ AngⅡ增加3H-亮氨酸掺入的作用可部分被PD098059所抑制;AngⅡ+HG增加3H-亮氨酸掺入的作用可显著被PD098059所抑制. 结论: 应用MAPK的特异性抑制剂PD098059抑制血管平滑肌细胞的增殖,证明MAPK激活在GS和/或AngⅡ导致平滑肌细胞增殖反应中有重要作用.
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脂联素对TNF-α介导的血管炎症反应的影响
目的:探讨脂联素对肿瘤坏死因子(TNF-α)引起的血管内皮细胞炎症反应的影响.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC).随机分为对照组,TNF-α刺激组和脂联素+TNF-α刺激组.HUVEC与脂联素联合孵育一段时间后再给予TNF-α刺激与单纯TNF-α刺激做对照,分别采用化学法,放免法及ELISA法检测脂联素对血管内皮细胞NO,iNOS,ET-1及MCP-1蛋白表达的影响.结果:HUVEC经TNF-α刺激6～12 h后其NO,iNOS,ET-1及MCP-1蛋白的表达(607.7±7.6,42.2±2.2,199.3±11.9,167.7±15.9)与对照组(543.5±2.2,23.8±2.0,148.4±5.3,128.0±8.4)相比明显增强(P＜0.05);当HUVEC在TNF-α刺激之前首先与脂联素共同孵育一段时间后,则血管内皮细胞NO,iNOS,ET-1及MCP-1蛋白的表达(565.7±13.0,36.5±2.7,170.8±8.3,142.6±5.6)与单纯给予TNF-α刺激相比明显减弱(P＜0.05).结论:脂联素可以通过抑制血管内皮细胞某些炎症因子的表达水平来调节血管内皮细胞的炎症反应,从而发挥其抗炎,抗动脉粥样硬化的作用.
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SiRNA对大鼠钙调神经磷酸酶活性及VSMCs增殖的影响
目的:观察神经肽Y(NPY)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中钙调神经磷酸酶(CaN)活性和c-fos表达水平的变化,以及RNA干扰抑制CaN活性的作用.方法:采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;NPY刺激培养的大鼠VSMCs增殖;RNA干扰特异性抑制CaN的活性及其mRNA的表达,阻断NPY刺激的大鼠VSMCs中CaN依赖的信号转导通路,观察对CaN活性、细胞增殖、核内原癌基因c-fos表达水平的变化.结果:NPY可增加VSMCs的CaN活性,加快细胞增殖及增加核内c-fos表达水平.RNA干扰抑制CaN活性后,明显降低NPY刺激的VSMCs增殖及核内c-fos表达水平.结论:CaN参与了NPY刺激的VSMCs增殖,RNA干扰通过抑制CaN的活性可阻断NPY诱导的VSMCs增殖作用.
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传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建
目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.
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携载VEGF基因的聚四氟乙烯血管材料对内皮细胞生长的促进作用
目的:研究聚四氟乙烯(PTFE)血管材料携载血管内皮生长因子(VEGF)基因并促进内皮细胞生长的可行性. 方法:将pCDI-hVEGF121/pCDI质粒溶液处理过的PTFE人工血管修剪成圆片,置于生理盐水中并于0.5, 1, 2, 4, 8, 16,24, 48和72 h测定溶液的吸光度,计算出溶液的DNA浓度,绘出体外释放曲线. 分离和培养人脐静脉内皮细胞,将内皮细胞种植到携带基因质粒的PTFE材料表面,在6, 24, 72和120 h检测细胞增殖情况并用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的表达量. 结果:体外释放曲线提示在0.5～4 h的这段时间内,质粒释放较快,随后进入缓慢增长期,直至72 h仍有质粒的释放. 在24, 72和120 h时间点,VEGF质粒组PTFE材料上的内皮细胞数和增长倍率都明显高于空质粒组材料(P<0.05),在6, 24, 72和120 h时间点,VEGF质粒组培养液的VEGF蛋白水平和增长倍率也明显高于空质粒组(P<0.01). 结论:证实了PTFE材料携带VEGF基因转染内皮细胞并具有促进其生长的可能性.
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骨髓来源血管内皮前体细胞的培养方法
目的: 明确骨髓单核细胞中是否存在血管内皮前体细胞(EPCs),在不同的培养条件下,细胞的增殖、分化是否受影响. 方法: 取SD大鼠股骨,用密度梯度离心法收集骨髓单个核细胞,分为3组,接种在EC基础培养基上:A组,在培养液中添加VEGF, bFGF;B组,与人脐静脉细胞共培养;C组为对照组. 分别在培养的第3, 7, 11和15日时,将细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪检测细胞总数、抗体标记阳性的细胞百分比. 结果: 培养7 d后,细胞逐渐成为梭形,呈现内皮细胞样的表现型,免疫荧光显示,细胞呈现Ⅷ factor relative antigen 及NOS3抗体阳性标记,说明细胞已分化为内皮细胞. 其中B组细胞总数、Ⅷ factor relative antigen 及NOS3的阳性细胞百分比均高于A, C组,有统计学差异(P=0). 结论: 骨髓细胞中存在EPCs,并可在体外分化为血管内皮细胞,与脐静脉内皮细胞共培养可一定程度地弥补生长因子的缺乏,但无法替代添加VEGF和bFGF.
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中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI-1表达影响
目的:探讨中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI-1的影响.方法:将72只SD雄性大鼠随机分为6个实验组,其中一组为阴性对照组,给以普通饮食,一组为模型组,给予维生素D3,高脂和高胆固醇饮食,其余4组在给予高脂、高胆固醇饮食建立动脉粥样硬化大鼠模型同时给予芪丹通脉片低剂量组[0.36g/(kg·d)]、中剂量组[1.08g/(kg·d)]、高剂量组[3.24g/(kg·d)]、阳性对照新伐他丁组[4 mg/(kg·d)](n=12).16 wk后电镜观察大鼠主动脉内皮细胞损伤情况,并通过逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测PAI-1表达.结果:模型组内皮细胞损伤严重、PAI-1表达明显高于对照组(P＜0.05);给予芪丹通脉片大鼠内皮细胞损伤减轻、PAI-1表达显著降低,中药高剂量组结果接近辛伐他丁组.结论:动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞损伤严重,其PAI-1表达增强,使用芪丹通脉片可明显改善内皮损伤程度,同时降低PAI-1表达,且其低、中、高浓度组PAI-1表达依次减少(P＜0.05).
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c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
目的: 构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶(Ribozyme)真核表达载体,探讨核酶对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法: 计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构,选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶.采用DNA合成仪合成核酶基因,以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf(+)体外转录载体,以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后,通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体;核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导,转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs,经G418筛选出细胞克隆,流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期.结果: 核酶基因准确克隆入pGEM3Zf(+)载体,DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确;经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体(pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆,扩大培养获得转染细胞;细胞周期分析显示,pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化,S期和G2/M期比率明显减少,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞增殖指数明显降低.结论: 特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用.
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胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
目的探讨胰岛素对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响. 方法体外进行大鼠血管平滑肌细胞的培养,以5～10代细胞为实验对象,随机分成空白对照组和胰岛素组,胰岛素组又按浓度1×10-9、1×10-8、1×10-7和1×10-6 mol*L-1分为4小组,在加药后24 h、48 h和72 h用MTT法分析细胞增殖活力,免疫细胞化学观察细胞核增殖抗原(PCNA) 的表达,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测H2O2诱导的细胞凋亡. 结果加药48 h后,1×10-9 mol*L-1胰岛素组的MMT A值(0.42±0.04)高于空白组(0.30±0.02),P<0.05,低于1×10-6 mol*L-1胰岛素组(0.52±0.05),P<0.05; 1×10-9 mol*L-1胰岛素作用48 h后细胞的MMT A值比空白组增加40%,高于24 h细胞的MMT A值增加率(27%),P<0.05;1×10-9～1×10-6 mol*L-1胰岛素作用48 h后细胞PCNA的表达率(50%～80%)均高于空白对照组的(30%) P<0.05;加药24 h后,1×10-6 mol*L-1胰岛素组细胞凋亡率(30%)低于空白组(70%) P<0.05. 结论胰岛素有明显促VSMC (vascular smooth muscle cells)增殖的作用,并且这种作用时间和浓度依赖性;同时胰岛素还可抑制VSMC凋亡.
