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艰难梭菌毒素B受体结合区的表达
目的 通过对艰难梭菌毒素B受体结合区进行基因克隆、表达,获得目的蛋白,为建立快速检测艰难梭菌的方法奠定基础.方法 复苏艰难梭菌,提取基因组DNA,PCR扩增目的基因,回收后与pGEM-T连接进行TA克隆,通过PCR、酶切及基因测序鉴定pGEM-T-CDB3.酶切pGEM-T-CDB3和pGEX-4T-1,回收CDB3和pGEX-4T-1,连接后转化大肠埃希菌BL21(DE3),构建重组质粒pGEX-4T-1-CDB3,然后应用IPTG诱导目的蛋白表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定目的蛋白大小和特异性.结果 经PCR扩增获得了艰难梭菌毒素B受体结合区(CDB3)基因全长片段1851 bp.克隆质粒pGEM-T与CDB3重组获得了质粒pGEM-T-CDB3,片段长为4800 bp左右.构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-CDB3,目的蛋白经诱导后获得表达.结论 原核蛋白表达载体pGEX-4T-1-CDB3构建成功,并大量表达出目的蛋白,将对艰难梭菌毒素B的快速检测和疫苗的研制奠定良好基础.(中华检验医学杂志,2013,36:324-328)
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艰难梭菌临床分离株病原学和分子流行病学及临床特征分析
目的：初步研究湘雅医院艰难梭菌临床分离株的病原学、毒素基因携带情况及核糖体分型情况，并对其临床特征进行分析，为临床提高艰难梭菌分离率以及采取积极有效的防控措施奠定基础。方法采用前瞻性研究，收集中南大学湘雅医院2012年6至12月腹泻患者粪便标本452份，对其进行选择性厌氧培养及API20A鉴定，并对阳性标本进行毒素基因检测（ tcdA、tcdB、cdtA、cdtB）和核糖体分型（16S-23S间隔区多态性）；收集所有患者临床资料，并对其进行Logistic回归分析筛选其发病高危因素。结果艰难梭菌检出率13.94％（63／452），其中42.86％（36／63）为 A－B＋型，14.29％（9／63）来自社区感染，二元毒素基因检测均为阴性；共检出11种核糖体型，其中CD017常见，占22.22％（14／63）；Logistic回归分析显示，年龄＞55（ P＝0.016； OR＝4.45；95％CI：1.33～14.91），腹泻次数（P＝0.007；OR＝0.03；95％CI：0.002～0.38）及腹泻持续时间（P＝0.015； OR＝7.86；95％CI：1.50～41.16）为其发病高危因素。结论艰难梭菌是湘雅医院腹泻患者重要致病菌，主要来自医院感染，A－B＋型检出率较高；核糖体分型存在相对优势型别CD017，无证据提示存在艰难梭菌感染的暴发流行。
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多重荧光PCR结合Allglo探针技术检测艰难梭菌相关毒素基因
目的 采用多重荧光PCR结合Allglo探针技术,建立一种快速、特异、灵敏的鉴定艰难梭菌相关毒素基因的方法,并对浙江杭州地区腹泻患者的产毒型艰难梭菌感染现状进行调查研究.方法 应用型研究.针对艰难梭菌毒素tcdA和tcdB基因设计引物和相应的Allglo探针,优化PCR扩增体系,并评价其特异性、灵敏度、重复性.收集2012年8至12月杭州市第一人民医院的门诊腹泻患者粪便标本共180份,对粪便中携带tcdA和tcdB基因的产毒型艰难梭菌进行鉴定,同时通过对tcdA和tcdB基因直接测序进一步验证荧光PCR检测结果的可靠性.结果 本试验建立的结合Allglo探针的多重荧光PCR方法可同时、准确、特异地鉴定艰难梭菌tcdA和tcdB基因,灵敏度可达10 CFU/ml.定量检测tcdA基因的循环阈值(Ct)值变异系数分别为2.30％、0.42％、0.81％,检测tcdB基因的Ct值变异系数分别为1.91％、1.02％、1.18％,均小于5％.在180份腹泻粪便样本中,检测出26份阳性样本,阳性率为14.4％,其中tcdA和tcdB毒素基因均阳性的样本为23份(23/26,88.5％),仅tcdA毒素基因阳性的样本为2份(2/26,7.7％);仅tcdB毒素基因阳性的样本为1份(1/26,3.8％).同时,采用直接测序方法对样本进行扩增检测和序列比对,与荧光定量PCR结果完全一致.结果显示浙江杭州地区腹泻患者感染的产毒型艰难梭菌以同时携带tcdA和tcdB毒素基因的菌株为主.结论 本研究建立的Allglo探针的多重荧光PCR方法可用于临床上快速、准确地检测产毒型艰难梭菌.
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艰难梭菌感染实验室诊断方法的研究进展
艰难梭菌是一种专性厌氧革兰阳性芽孢杆菌,一般认为是环境和人类肠道中的正常菌群.长期应用抗生素、免疫抑制剂或化疗药物使耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素是导致艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的主要因素.CDAD的发病率在全球范围内不断上升,尤其是高产毒株在北美地区引起了医院内的暴发流行,引起了世界范围的关注.在此对艰难梭菌的致病机制和实验室诊断方法的研究进展进行阐述,为CDAD的早期诊断和治疗提供新思路.
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艰难梭菌疫苗的研究进展
近年来艰难梭菌感染性疾病发病危险因素在增加，如潜在的基础疾病、住院时间、年龄、抗生素的使用、质子泵抑制剂的使用等，尽管出现了利福昔明、硝唑尼特、替加环素、雷莫拉宁、非达霉素等新型抗生素以及腔内毒素中和剂、生物治疗剂、粪便移植、全身抗体方法、静脉注射免疫球蛋白等非抗菌药物，艰难梭菌感染率及复发率仍居高不下，疫苗是防治艰难梭菌感染的理想的途径和方法。艰难梭菌疫苗的研究已近20年，目前除了针对A毒素与B毒素的单克隆抗体疫苗、类毒素疫苗在人体中取得较好的效果外，一些针对毒素受体及艰难梭菌关键致病因子的基因重组疫苗在动物实验中也取得了良好的防治效果。（中华检验医学杂志，2014，37：430-433）
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抗生素相关性腹泻患儿艰难梭菌感染分析
目的 探讨抗生素相关性腹泻(AAD)患儿艰难梭菌(CD)感染的阳性率及治疗转归情况.方法 收集2012年1月至2014年1月武汉市妇女儿童医疗保健中心和湖北省通城县人民医院577例AAD患儿的临床资料,按照不同年龄将AAD患儿分为3个月～1岁、＞1 ～4岁、＞4 ～12岁和＞12 ～18岁四组,同时选择220名不同年龄健康儿童作为正常对照组.采用谷氨酸脱氢酶免疫法和PCR二步法检测患儿CD感染,分析不同年龄AAD患儿CD感染的阳性率.将AAD患儿分为轻型、一般型和严重型并给予分级管理治疗,一般型和严重型患儿给予甲硝唑和(或)万古霉素治疗,比较各组转归.结果 577例AAD患儿中3个月～1岁、＞1 ～4岁、＞4 ～ 12岁、＞12 ～ 18岁分别为178例、177例、132例、90例.＞1 ～4岁AAD患儿CD感染阳性率为22.0％ (39/177),与正常对照组阳性率4％ (4/91)相比差异有统计学意义(P=0.000);＞4 ～12岁AAD患儿CD感染阳性率为21.2％ (28/132),与正常对照组阳性率4％(2/53)相比差异有统计学意义(P =0.004);而3个月～1岁和＞12 ～18岁AAD患儿CD感染阳性率与正常对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).577例AAD患儿中轻型285例(无CD感染患儿),一般型176例(CD感染患儿47例),严重型116例(CD感染患儿81例).经分级对症治疗后128例CD感染患儿有16例复发腹泻(均为严重型),其余患儿全部痊愈.16例复发腹泻患儿2例转院,2例死亡,余12例使用甲硝唑、万古霉素、益生菌和其他对症治疗后全部痊愈出院.结论 ＞1 ～12岁AAD患儿CD感染阳性率较高.甲硝唑和(或)万古霉素治疗对CD感染有效.
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健康儿童产毒艰难梭菌定植率研究
目的 调查健康儿童中产毒的艰难梭菌定植情况,了解各年龄段产毒艰难梭菌的定植率及其毒素类型.方法 病例观察性研究,连续性收集2014年9月至2015年1月北京儿童医院保健科健康儿童的粪便标本,按年龄分4组,分别是＜1岁53例,1～＜3岁、3～＜6岁和6～ ＜14岁组各50例,共203例,应用PCR检测艰难梭菌的毒素基因,包括tcdA、tcdB及二元毒素基因,并检测其毒素调节基因,包括tcdC、tcdD、tcdE.对阳性结果进行基因测序分析.计量资料组间比较采用t检验、秩和检验,计数资料采用x2检验.结果 入组的203例标本中共检测出产毒艰难梭菌阳性标本15例(7.4％),其中tcdA阳性而tcdB阴性(A+B-)基因型8例,tcdA、tcdB均阳性(A+B+)基因型4例,tcdA阴性而tcdB阳性(A-B+)基因型3例(20.0％),未检测到二元毒素阳性标本.tcdC、tcdD、tcdE基因阳性的标本分别为8例(53.3％)、6例(40.0％)、11例(73.3％).tcdA、tcdB、tcdC、tcdD、tcdE基因阳性标本经测序未发现基因突变.在15例阳性标本中,＜1岁组检出4例(4/53,7.5％);1～＜3岁组检出4例(4/50,8.0％);3～＜6岁组检出1例(1/50,2.0％);6～＜14岁组检出6例(6/50,12.0％),各年龄组产毒艰难梭菌定植率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本组产毒的艰难梭菌在健康儿童中的定植率为7.4％,且各年龄组均可检测到产毒的艰难梭菌.
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成人住院患者抗菌药物相关性腹泻临床分析
目的 了解住院成人患者抗菌药物相关腹泻(AAD)的发生情况、导致AAD的主要药物种类以及AAD的主要临床特征,以加强对该不良反应的防范. 方法 收集2016年1月1日至2017年5月31日在首都医科大学附属北京同仁医院住院期间应用抗菌药物治疗成年患者的病历资料进行回顾性分析.利用医院信息系统收集发生AAD患者的电子病历,提取相关数据,对引起腹泻的抗菌药物品种、AAD的临床特征及预后进行描述性分析.采用帕累托分析法分析AAD的主要发生病房和导致AAD的主要抗菌药物,并对AAD患者抗菌药物的使用合理性进行点评. 结果 共收集到使用抗菌药物的住院成年患者2 406例,其中85例发生AAD,发生率为3.5%.85例患者中男性48例,女性37例;中位年龄68(31,93)岁,年龄≥60岁者70例(82.3%);来自重症监护病房者28例(32.9%),干部保健病房22例(25.9%),内科普通病房18例(21.6%),急诊综合病房13例(15.3%),外科病房4例(4.7%).帕累托图分析结果显示,重症监护病房、干部保健病房和内科普通病房是AAD的主要发生病房.抗菌药物应用情况:85例患者中使用一联抗菌药物治疗者62例(72.9%),包括使用第三、四代头孢菌素类药物者23例、头霉素类药物13例、广谱青霉素类药物11例、碳青霉烯类药物10例、喹诺酮类药物3例、第二代头孢菌素类药物2例;使用二联抗菌药物治疗者23例(27.1%),所用药物中均含有第三、四代头孢菌素类、广谱青霉素类或头霉素类药物.帕累托图分析结果显示,第三、四代头孢菌素类、头霉素类和广谱青霉素类是导致AAD的主要药物.腹泻发生在抗菌药物用药后1～30 d,平均(7.5 ± 6.4)d.85例患者中26例(30.6%)大便难辨梭菌毒素检测阳性,其中8例诊断为伪膜性肠炎,占AAD的9.4%,占难辨梭菌性腹泻的30.8%.给予肠道微生态类药物(80例)、蒙脱石散(60例)、甲硝唑(18例)、万古霉素(10例)等药物治疗,2～40 d后48例(56.5%)痊愈,35例(41.2%)好转,2例(2.3%)无效.抗菌药物临床应用合理性点评结果显示,85例AAD患者中有4例(4.7%)存在不合理使用抗菌药物的情况,其中剂量不合理和联合用药不合理各2例. 结论 北京同仁医院成年住院患者AAD发生率为3.5%,其中30.6%为难辨梭菌性腹泻,9.4%发生伪膜性肠炎.导致AAD的主要药物为第三、四代头孢菌素类、头霉素类和广谱青霉素类药物.
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艰难梭菌在儿童中的定植与感染
艰难梭菌是可以在次级端形成芽孢的革兰阳性杆菌,是引起抗生素相关性腹泻(antibiotic-associate diarrhea,AAD)的常见病原菌之一,约15%～39%的AAD由艰难梭菌引起,且在成人中随着年龄的增长其发病率呈现增高的趋势[1].
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罗马Ⅲ标准诊断的肠易激综合征患者中无致病性难辨梭状芽孢杆菌感染
背景:近年来难辨梭状芽孢杆菌(C.difficile)感染率上升.一些轻症C. difficile 感染者症状酷似腹泻型或混合型肠易激综合征(IBS-D或IBS-M),但以一般方法难以检测C. difficile.目的:评估临床上根据罗马Ⅲ标准诊断为IBS-D或IBS-M的病例中是否有一部分与致病性C.difficile现症感染或携带C.difficile有关.方法:连续纳入符合IBS罗马Ⅲ诊断标准的120例IBS-D或IBS-M患者,应用VIDAS(R) C.difficile A毒素Ⅱ(CDA2)试剂盒.以酶联荧光测定(ELFA)技术检测粪便样品中的C.difficile毒素A,如结果可疑,则进一步行CDA2阻抑(CDB)测试以提高分辨率.结果:120例IBS-D和IBS-M患者粪便滤液中均未检测到C.difficile 毒素A.结论:本组根据罗马Ⅲ标准诊断的IBS-D和IBS-M患者无致病性C.difftcile现症感染或携带C.difficile,无证据支持这部分患者需常规使用甲硝唑等抗生素.
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难辨梭状芽孢杆菌相关性腹泻研究进展
难辨梭状芽孢杆菌是一种革兰阳性肠道病原体.难辨梭状芽孢杆菌相关性腹泻(CDAD)及其引起的假膜性肠炎为消化道多发病.难辨梭状芽孢杆菌可产生毒素A和毒素B．侵入肠黏膜后引起细胞病变,导致一系列感染相关临床表现.免疫学机制在难辨梭状芽孢杆菌感染相关疾病的发病中起重要作用.本文就CDAD的发病机制、临床表现及其检测和治疗作一综述.
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粪菌移植的研究进展
难辨梭状芽孢杆菌感染(CDI)是临床上常见的问题,其发病率、复发率和严重程度逐年升高.CDI治疗手段有限,特别是针对复发性CDI的抗菌药物治疗面临诸多棘手的问题.粪菌移植(FMT)近来重新引起关注,对治疗复发性CDI显示出很好的疗效;此外,FMT在炎症性肠病(IBD)的治疗方面也应用较多.但现阶段FMT的临床应用和普及仍存在诸多问题.
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艰难梭菌数字化聚合酶链反应-核糖体分型方法及参考图谱的建立
目的 建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法及常见基因型的参考图谱.方法 利用荧光毛细管电泳技术代替琼脂糖凝胶电泳检测艰难梭菌PCR-核糖体分型产物,建立数字化PCR-核糖体分型方法;利用40株分属于10种核糖体型(RT)的艰难梭菌参考菌株构建常见基因型的数字化参考图谱.结果 荧光毛细管电泳技术准确地检测出40株艰难梭菌参考菌株的PCR-核糖体分型片段,并以数字化的形式呈现,10种核糖体型艰难梭菌的PCR-核糖体分型数字化图谱差异明显.同为RT027的21株菌株间、RT002的3株菌株间和RT015的2株菌株间的数字化分型结果相似性都非常高,而7株RT001菌株则可分为4种亚型,2株RT014分为2种亚型.结论 成功建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法,同时构建了艰难梭菌10种核糖体型的数字化PCR-核糖体分型参考数据库.
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莫西沙星耐药的艰难梭菌多重聚合酶链反应检测和基因分型
目的：建立一种多重 PCR 方法用于莫西沙星耐药的艰难梭菌鉴定和初步基因分型。方法根据艰难梭菌 slpA 可变区间核苷酸序列的差异设计5种 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的特异性 PCR 引物，同时加入检测艰难梭菌管家基因磷酸甘油醛异构酶基因 tpi 的种特异性引物，构建多重PCR 方法；利用9种肠道常见的正常或致病菌验证多重 PCR 方法的特异性，利用46株分属于11个slpA 基因型的艰难梭菌参考菌株来验证方法的检测和分型能力；利用建立的多重 PCR 方法检测39株莫西沙星耐药的临床菌株，以 slpA 测序分型法为参照方法，评估该方法的临床实用性。结果多重PCR 检测9种肠道常见的正常或致病菌 tpi 和5种 slpA 基因型均为阴性；46株艰难梭菌参考菌株 tpi均为阳性，36株分属于5种靶 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的菌株被正确分型，10株分属于其他6种基因型的参考菌株均无法分型。39株莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株 tpi 均为阳性，32株检出具体基因型，其中22株为 slpA 基因型 gc08，6株为 hr，2株为 fr，2株为078，与 slpA 测序分型结果一致；7株多重 PCR 无法分型，slpA 测序分型结果显示其基因型均不包含在多重 PCR 分型范围内。结论成功建立一种简单、快捷、临床实验室适用的艰难梭菌检测，且能够分辨出5种 slpA 基因型的多重PCR 方法；莫西沙星耐药的艰难梭菌主要为 slpA 基因型 gc08。
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炎症性肠病住院患者216例的难辨梭状芽孢杆菌感染危险因素和预后
目的 分析IBD住院患者的难辨梭状芽孢杆菌感染(CDI)的危险因素和预后.方法 纳入2014年3月至2015年2月首次住院的216例IBD患者,在入院后立即留取粪便进行难辨梭状芽孢杆菌培养,同时采用PCR法检测难辨梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B.分析纳入患者CDI的发生情况和危险因素.统计学分析采用卡方检验或非参数检验.结果 216例IBD患者中,UC 73例,CD 143例.IBD患者的CDI阳性率为13.9％(30/216).UC患者的CDI阳性率为24.7％(18/73),高于CD患者的8.4％(12/143),差异有统计学意义(x2=10.690,P＜0.01).随着疾病严重程度的增加,UC中CDI阳性患者比例增加,3例缓解期、17例轻度活动期、23例中度活动期和30例重度活动期患者中CDI阳性者分别为0、2、5、11例,差异有统计学意义(x2=4.820,P=0.028).UC患者中,CDI阳性和阴性组有入院前3个月内的外院住院史者分别占6/18和7.3％(4/55),差异有统计学意义(x2=5.740,P=0.020);两组有入院前30 d内的PPI用药史者分别占7/18和7.3％(4/55),差异有统计学意义(x2=8.270,P=0.004).CDI阴性的UC患者住院时间为7.0 d(5.0 d,12.0 d),短于CDI阳性患者的10.5 d(8.8 d,18.2 d),差异有统计学意义(U=277.000,P=0.005).CDI阴性CD患者检测CDI后3个月内肠道切除手术率为10.7％(14/131),低于CDI阳性患者的5/12,差异有统计学意义(x2=4.520,P=0.010).结论 国内住院IBD患者有较高的CDI发生率,UC尤为显著,其危险因素包括病情重、入院前3个月内的外院住院史和入院前30 d内的PPI用药史,CDI与预后不良有关.
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ChromID对艰难梭菌诊断价值的Meta分析
目的 通过Meta分析在较大样本量前提下,系统评价ChromID对艰难梭菌感染(CDI)的诊断价值.方法 制定文献纳入、排除标准,通过计算机检索Pubmed、Cochrane图书馆、中国生物医学文献数据库(CBM)、中国期刊全文数据库(CNW)和万方数据库等,获取有关ChromID检测艰难梭菌的文献,检索关键词为ChromID、clostridium difficile、chromogenic agar,根据纳入、排除标准对文献进行筛选,并采用质量评价工具QUADAS对文献进行质量评价,提取数据.应用Meta-disc1.4软件进行分析.结果 终纳入5篇文献,样本量共1 851例.纳入文献均为中高质量文献,进行异质性检验提示无阈值效应,但存在其他原因导致的非阈值性异质性,采用随机效应模型进行Meta分析.ChromID诊断粪便48 h培养诊断结果的合并敏感度为0.793(95％CI:0.750～0.832)、合并特异度为0.942(95％ CI:0.972 ～0.955)、合并阳性似然比为16.817(95％ CI:7.042～40.157)、合并阴性似然比为0.124(95％ CI:0.040 ～0.386)及诊断优势比为244.64(95％ CI:17.711～3 379.3).受试者工作曲线下面积(AUCSROC)为0.981 4以及Q*指数为0.939 9.结论 通过对ChromID对艰难梭菌感染诊断价值进行Meta分析,发现ChromID具有较高的敏感度、特异度、阳性似然比及阴性似然比,可推荐应用于临床.
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艰难梭菌相关性腹泻的实验室诊断
艰难梭菌(C.Diff)是导致抗菌药物相关性腹泻、医院性腹泻及假膜性肠炎的主要病原菌[1-2].近年来,C.Diff在欧美国家蔓延较快,特别是高致病性菌株的出现,临床症状严重程度、复发率及死亡率明显上升,引起医学界越来越多的关注[2],对C.Diff感染的临床诊断和治疗也提出了新的挑战.国内对C.Diff感染研究不多,开展C.Diff培养、检测的实验室也很少.本文就C.Diff感染致病机理及实验室诊断方法、临床应用优缺点进行了较为全面的综述.
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快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究
目的 建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法.方法 针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物.采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价.同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较.结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性.LAMP低检测限为10 CFU/mL,灵敏度较高.对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P＞0.05,χ2=0.142 9).结论 本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测.
