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结核分支杆菌基因组DNA指纹技术在结核病流行病学中的应用
结核分支杆菌基因组DNA指纹技术，可以在种、株水平对结核分支杆菌进行鉴定，因此在结核病学的多个领域，尤其是流行病学中有很大的应用价值。 一、结核分支杆菌基因组DNA指纹技术及标准方法的确立 将结核分支杆菌的基因组DNA采用特殊的技术切割成大小不同的片段，电泳分离，就可以清楚地看到像人的皮肤指纹一样具有特征性的条带。这就是结核分支杆菌的DNA指纹。建立结核分支杆菌DNA指纹的主要技术有：限制性片段长度多态性(RFLP)方法和聚合酶链反应（PCR）方法。RFLP方法为：针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段，如插入序列IS6110［1］、IS1081［2］，多态性富含GC重复序列［3］，（GTG）5寡聚脱氧核苷酸［4］等，利用限制性内切酶酶切特征性片段上的某一位点，电泳分离、Southern blot而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法具有良好的特异性和稳定性，已成为结核分支杆菌株水平鉴定的主要方法［5，6］。PCR方法为：针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段，如IS6110、DR［7］、16S rDNA［8］，设计特异的引物进行多种方式的聚合酶链反应，电泳分离，而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法简单快速，但特异性和稳定性不及RFLP方法，目前作为RFLP方法的补充。
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湖北省不同地区汉坦病毒的基因型研究
目的对分离自湖北省不同地区的30株汉坦病毒(HV)RNA M片段进行分析,以了解湖北省不同地区HV的基因特征及基因组功能.方法参考HV的基因文库软件设计M片段G1区型特异性引物,用适合于湖北省HV分型的逆转录-半巢式聚合酶链反应(RT-heminestedPCR),并结合限制性内切酶酶切图谱分析,对湖北省不同地区分离的30株HV进行分型、酶切.结果分离于湖北省不同地区的30株HV的分型结果为汉滩型21株、汉城型9株.21株汉滩型靶基因被HinfⅠ、HaeⅢ消化的图形与标准株76/118株的图形一致,未见与H-114株相似的图形,其中武汉和洪湖各有l株靶基因HaeⅢ消化只见1个片段;应城、江夏、黄陂和麻城各有1株靶基因HinfⅠ消化有3个片段.另外21株汉滩型靶基因除前述的应城毒株外均被HincⅡ消化.9株汉城型靶基因不能被HaeⅢ消化;HinfⅠ消化只见2个片段,而EcoRⅠ消化却见2个片段,与R22株消化的图形不一致.结论湖北省HFRS流行为混合疫区;汉城型M片段基因稳定,汉滩型M片段基因不稳定,且在湖北地区具有一定的地理聚族性.
关键词： 肾综合征出血热 汉坦病毒 基因型 逆转录-聚合酶链反应 限制性内切酶酶切 -
肿瘤坏死因子α及β基因多态性与脑梗死关系的研究
目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)及β(TNF-β)基因多态性与脑梗死(CI) 的相关性.方法 用序列特性引异物和聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶切技术, 对110例脑梗死患者(CI 组) 和110例健康者(对照组)的肿瘤坏死因子α及β基因多态性进行分析.结果 CI组TNF-α等位基因分布频率与对照组比较差异有显著性 ( P＜0.05 ) ,CI组 TNF-αA等位基因频率为0.0364, 对照组为0.1091, 两组比较有统计学差异(P＜0.05); CI组TNF-β等位基因分布频率与对照组差异有显著性 (P＜0.05), 其中TNF-βA/A基因型频率(41.82%)明显高于正常人(26.36%),但G与A的含量差异无显著性(P＞0.05).结论 肿瘤坏死因子α基因多态性与CI的发病有一定相关性,TNF-β等位基因分布频率与CI的发病有一定相关性.
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长期低剂量镉致正常肝脏细胞异常增殖及其与caspase－8甲基化的关系
目的：应用L－02细胞建立长期低剂量镉转化细胞模型。观察转化细胞形态学变化，检测转化细胞增殖、凋亡和甲基化的改变，探讨长期低剂量镉导致细胞转化的机制。方法：采用MTT法、形态学分析、Western blot、细胞克隆形成、流式细胞术、限制性内切酶酶切电泳和MSP。分组：对照组、CDT－L－02组、5－aza组和CDT－L－02＋5－Aza组。结果：（1）1μmol／L氯化镉培养L－02细胞第2周时，细胞长轴逐渐变长；10周时，细胞从方形变成长梭形；与对照组相比，转化细胞DNMT1表达稳定升高， caspase－8表达稳定下降。与对照组L－02细胞相比，转化细胞的增殖率，克隆形成率明显升高。（2）转化细胞在甲基化抑制剂5－Aza的作用下，与对照组相比，增殖率明显下降，凋亡率明显增加；DNMTs、caspase－8与凋亡和周期相关蛋白的表达在5－Aza的作用下恢复到对照组的水平；基因组和caspase－8基因启动子甲基化的水平也有所恢复。结论：长期低剂量镉能促进正常肝细胞L－02增殖增加，凋亡减少，导致正常细胞发生转化，其机制是提高了基因组DNA和caspase－8基因启动子甲基化的水平。
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肿瘤坏死因子α及β基因多态性与多发性硬化关系的研究
目的探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)及β(TNFβ)基因多态性与多发性硬化(MS)的相关性.方法采用序列特异性引物和聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶切技术对60例MS患者(MS组)和110例健康者(对照组)的TNFα及β基因多态性进行分析.结果MS组TNFα-308等位基因分布频率与对照组比较有显著性差异(P=0.04),且MS组等位基因A含量(3.3%)与对照组(11.8%)比较也有显著性差异(P=0.008);MS组TNFβ+252等位基因分布频率与对照组比较有显著性差异(P=0.014),且MS组等位基因A含量(69.2%)与对照组(55.5%)比较也有显著性差异(P=0.014).结论TNFα-308A等位基因的多态性与MS的发病有一定负相关,TNFβ+252A等位基因频率及TNFβ+252 A/A基因分布频率与MS的发病有一定正相关.
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抗LPS mAb Fab片段cDNA的克隆及其在CHo细胞中的表达
[马越云,马文煜,于文彬,尹文,苏明权,丁振若.细胞与分子免疫学杂志,2001;17(3):280-283]目的构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法以逆转录PCR方法扩增抗LPSmAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-T easy.经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3 LC,并以PCR方法扩增pcDNA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGH Poly(A)在内的轻链表达序列.经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3-Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcDNA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞.经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Western blot鉴定阳性克隆.结果用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株.Western blot显示,表达产物的Mr为50 000.同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LPS的活性.结论成功地在CHO细胞中表达抗LPS mAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础. (井晓梅)
