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抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的新型单克隆抗体的制备及其临床应用
目的 制备抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)特定抗原肽的单克隆抗体,为建立结核病临床早期诊断的免疫学方法奠定物质基础.方法 设计并合成结核分枝杆菌CFP-10第53 ～ 66位氨基酸(14肽AAVVRFQEAANKQK)作为特定的抗原肽序列,经免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化该单克隆抗体,进行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法(Western blotting)、免疫沉淀法和ELISA检测中的应用效果.共检测结核分枝杆菌培养上清样本38份,非结核分枝杆菌培养上清样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份.结果 单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞系产生的抗体类型为IgG1和κ型.该抗结核分枝杆菌CFP-10特异性单克隆抗体可成功用于Western blotting和免疫沉淀法分析.ELISA定量检测显示,该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感性为78.6％ (55/70),特异性为92.2％ (59/64).结论 CFP-10特定抗原肽单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断.
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结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10及rCFP10-ESAT6融合基因在大肠埃希菌中的表达及比较
目的 构建结核早期分泌抗原靶分子(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)及重组CFP10-ESAT6(rCFP10-ESAT6)融合蛋白的原核表达载体,获得纯化蛋白并比较三者表达特点.方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增ESAT-6、CFP-10基因片段,融合PCR技术扩增rCFP10-ESAT6片段,分别连接到pGEM-T载体,测序正确后插入原核表达载体pET-32a(+)或 pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化3种蛋白;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot分析验证目的蛋白的抗原特异性.结果 pET-32a(+)-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达,分子量为31 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的42%;pET-32a(+)-CFP10、pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组蛋白以可溶性形式表达,分子量分别为33 kD和28 kD,目的蛋白分别占菌体总蛋白的73%和48%;Western blot证实其均具有良好的抗原性.亲和层析法获得了纯度较高的重组蛋白.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)成功表达了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10融合蛋白及rCFP10-ESAT6重组蛋白,为深入研究其免疫原性和生物学特性奠定了基础.
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结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒的构建及表达
目的 构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白.方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-32a( +)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确；表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8％,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应.结论 成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21( DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础.
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重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用
目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RDl区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein 10,CFPl0)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接EHSA法.方法 采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白；分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接EHSA法；采用方阵滴定法对建立的间接EHSA法的条件进行优化；并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证.结果 纯化的重组CFPl0-PPE68融合蛋白纯度约为70％.分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗佳稀释度均为1:5000.3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均佳；3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低.结论 以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值.
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培养滤液蛋白10/靶6000蛋白检测对结核性脑、胸膜炎早期诊断的临床研究
目的 探讨靶6000蛋白(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)在早期辅助诊断结核性脑、胸膜炎中的价值.方法 将收集的29例阳性病例(结核性脑膜炎及胸膜炎的患者)和30例对照病例应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其脑脊液或胸水ESAT-6和CFP-10蛋白,并与用聚丙烯酰胺凝胶块浓缩脑脊液或胸水后检测ESAT-6和CFP-10蛋白浓度进行比较.结果 浓缩前的标本:CFP-10的灵敏度为62.1％,特异度为86.7％；ESAT-6的灵敏度为68.9％,特异度为90％;两蛋白联合诊断的灵敏度为79.3％,特异度为96.7％.浓缩后的标本:CFP-10的灵敏度为68.9％,特异度为86.7％；ESAT-6的灵敏度为72.4％,特异度为90％；两蛋白联合诊断的灵敏度为89.6％,特异度为96.7％.浓缩前后病例组与对照组的CFP-10和ESAT-6蛋白的阳性率差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 ESAT-6和CFP-10检测结核具有较高的灵敏度和特异度,且简便和廉价,适合用于早期辅助诊断.
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和厚朴酚抑制CFP-10、ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子表达
目的 研究和厚朴酚(HNK)对早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)作为特异性抗原刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)炎症因子表达的抑制作用,探讨抗炎在结核病治疗中的潜在价值.方法 用MTS法检测HNK(0～80μmol/L)对A549细胞的毒性反应,确定合适的药物实验浓度.用ELISA法检测以CFP-10、ESAT-6(0～40μg/ml)为抗原刺激的A549表达IL-8水平,选择适刺激浓度.将A549细胞与CFP-10,ESAT-6及不同浓度的HNK(0～20μmol/L)共同培养24h后收集培养上清液和细胞,用ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的表达水平,分析HNK对细胞因子的剂量依赖抑制.结果 20μmol/L及以下的HNK浓度对A549细胞无明显毒性反应.抗原适刺激浓度为5μmol/L.CFP-10,ESAT-6刺激可显著诱导A549细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的产生.HNK(0～20μmol/L)剂量依赖性地抑制CFP-10,ESAT-6诱导的炎症因子的表达.结论 HNK能有效抑制CFP-10,ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的表达.
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用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备
目的 通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA),CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度高、稳定性好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品.方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性.三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价.结果 成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上.三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度高(0.02μg/L),稳定性好.结论 得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础.
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结核杆菌特异性抗原对结核病诊断价值研究
目的 从人血清提取结核杆菌早期分泌性抗原靶6、培养滤液蛋白、结核杆菌分泌蛋白38KD进行标测.探讨结核病诊断新方法. 方法 选择我院2007年1月～2008年1月间住院肺结核病人和健康查体者,应用结核分枝杆菌相关性抗原ESAT-6、CFP10、38KD检测试荆盒测定血清结核菌抗原水平,同时对所有入选者均行结核菌培养.结果 活动性肺结核患者血清中检测到结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP10、38KD的阳性率高,与健康对照组有统计学差异(P<0.005);结核分枝杆菌抗原可区分结核感染和非感染,与结核菌素试验比较有显著的统计学差异(P<0.001).结论 血清结核杆菌特异性抗原能够作为诊断结核病的依据,对鉴别活动性肺结核、非活动性肺结核、非结核病具有重要的价值.
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CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达
目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESA T6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白.方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESA T6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68.再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESA T6-PPE68基因,GeneSOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化人大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD.结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础.
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结核疫苗优势抗原ESAT6、CFP10的分子生物学基础及应用研究进展
早期分泌抗原靶分子6(ESAT6,后简称E6)和培养滤液蛋白10(CFP10,后简称C10)因能诱导宿主产生强烈细胞免疫应答,成为新型结核(TB)疫苗的热门优势抗原,在TB的预防、诊断等领域具有广阔的应用前景.本文汇集国际新进展,从E6、C10的结构-功能、生物学特性、表达-分泌、宿主免疫及疫苗研究等全新视角对其进行分析与展望.
