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放射耐受食管鳞癌细胞系基因表达谱研究
目的 构建放射耐受食管鳞癌细胞系,筛选放射耐受相关基因及探索耐受机制.方法 利用放射线反复照射食管癌细胞系KYSE410,构建放射耐受细胞系KYSE410-res.检测照射前后食管癌细胞增殖与凋亡情况,通过基因芯片技术检测放射线处理前后食管癌细胞基因表达差异情况,并对差异明显的基因进行验证.采用成组t检验.结果 KYSE410-res细胞较KYSE410细胞抗凋亡能力和增殖能力显著提高(P值均＜0.05).基因芯片结果显示KYSE410-res细胞中表达上调≥4倍基因有463个,下调≥4倍基因有251个.差异表达基因的功能主要集中在细胞增殖、粘附、信号转导、血管生成、活性氧代谢、细胞损伤修复及MAPK/ERK信号通路,OAS2和UBD是重要节点蛋白.荧光定量PCR法检测HLA-DQB1、MMP1、NCAM1、ZNF521、GPC6、SELENBP1、LCN15、TFPI-2基因在KYSE410-res细胞中表达情况与基因芯片结果一致.结论 MAPK/ERK信号通路的异常激活、OAS2和UBD基因的表达上调、TFPI-2基因的表达下调伴随MMPs的表达上调,可能是食管癌细胞放射耐受的机制之一.
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miR-193a-3p在食管癌细胞放射抵抗作用的初步研究
目的：探讨miR?193a?3p在食管鳞癌放射耐受性机制中的作用。方法通过6 MV X射线对4个食管癌细胞系进行照射，采用MTT法检测出相对敏感系及耐受系细胞；茎环引物实时定量PCR法检测miR?193a?3p、miR?155、miR?22?3p在2个细胞中的表达，miR?193a?3p作为表达差异较为明显的 microRNA 被挑选进行下一步研究。分别合成并转染 miR?193a?3p 的 mimic （3PM）或antagomiR （3PA）序列及小干扰RNA （si?LOXL4）以提高或抑制其在细胞中的表达水平，MTT法和流式细胞分析术检测miR?193a?3p及其下游基因LOXL4对于放射敏感性的影响。结果筛选出相对放射敏感细胞系（ KYSE510）及耐受细胞系（ KYSE410）；miR?193a?3p在两系细胞中的表达水平差异显著高于miR?155、miR?22?3p （1.00∶21.13）；KYSE510细胞中转染mimic提高其表达后，与对照组相比，其放射敏感性降低，细胞凋亡比例显著下降11.10％（P＜0.05），而 KYSE410细胞中转染 antagomiR后，其敏感性增加（ P＜0.05）。作为miR?193a?3p的下游基因，LOXL4的表达抑制也受到miR?193a?3p的调控，转染si?LOXL4降低其表达，与对照组相比放射敏感性也降低，细胞凋亡比例下降7.07％（ P＜0.05）。结论 miR?193a?3p可能通过调控基因LOXL4促进食管癌细胞放射耐受性。
关键词： miR-193a-3p 细胞系 食管癌 放射耐受 小干扰RNA -
肿瘤干细胞在食管癌放射线抵抗中的作用及分子机制研究
目的：探究肿瘤干细胞在食管癌放射线抵抗中的作用及其分子机理，为食管癌的放疗提供理论参考。方法采用8 GyX线照射食管癌细胞系TE1，建立并筛选出放射线抵抗的食管癌细胞系TE1－res。利用细胞计数法比较增殖情况，采用流式细胞术比较CD44（ high） CD24（－） CD133（＋）分子表达及其凋亡情况，克隆形成实验比较克隆形成率及细胞存活曲线，BSP方法比较抑癌基因甲基化程度。成组t 检验或方差分析差异。结果 TE1－res 细胞比 TE1细胞增殖能力增强（平均值20．84×105∶4．46×105／d，P＝0．008），CD44（high） CD24（－）CD133（＋）细胞比例升高[（38．0±2．9）％∶（10．1±1．3）％，P＝0．001]，抗凋亡能力增强（平均值33．23％∶10．50％，P＝0．003），8 Gy照射后克隆形成率升高[（14．3±2．6）％∶（0．9±0．3）％，P＝0．011]，D0值升高（3．28 Gy ∶2．19 Gy，P＝0．125）， SPINT2、CDKN1B、DKK1、TP53、PPP2R1B抑癌基因启动子区甲基化水平升高[（89．7±4．9）％∶（5．0±0．5）％（P＝0．001）、（92．3±4．7）％∶（10．4±0．7）％（P＝0．001）、（90．7±3．7）％∶（7．9±0．4）％（P＝0．001）、（83．4±5．7）％∶（17．2±1．2）％（P＝0．002）、（90．2±6．7）％∶（4．4±1．2）％（P＝0．002）]。结论肿瘤干细胞在食管癌放射线抵抗中具有重要作用，放射线抵抗与SPINT2、CDKN1B、DKK1、TP53及PPP2R1B等抑癌基因启动子区的高甲基化水平密切相关。
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γ射线增强喉癌细胞hTERTp启动子活性研究
目的 探讨γ射线对喉癌细胞中端粒酶逆转录酶基因启动子(hTERTp)活性的影响,以及通过射线增强hTERTp下游基因表达的可行性.方法 将含hTERTp的质粒转染细胞,采用报告基因评价启动子活性,通过RT-PCR和酶活性检测观察射线作用下hTERTp调控辣根过氧化物酶(HRP)的表达,克隆形成实验评价射线对phTERTp-HRP/IAA杀伤和放射增敏作用的影响.结果 在Hep-2细胞中,6 Gy γ射线照射后hTERTp活性是0 Gy照射后的2.96倍,在Hep-2R细胞中是1.60倍.质粒phTERTp-HRP转染Hep-2和Hep-2R细胞后,6 Gy照射组的HRP mRNA分别增高2.1和1.1倍,酶活性分别增高2.54和1.23倍.6 Gy联合吲哚乙酸(IAA)组Hep-2细胞的存活分数为1.3%,Hep-2R细胞的存活分数为3.5%,比对照组明显降低(F=234.280和F=357.148,P值均＜0.01).6 Gy联合IAA组与IAA组相比,放射增敏比SERSF2分别为1.52(Hep-2)和1.68(Hep-2R),存活曲线的参数α分别为0.416、0.099(Hep-2)和0.356、0.090(Hep-2R).结论 γ射线可以增强不同放射敏感性喉癌细胞hTERTp活性,增强下游基因表达.射线联合phTERTp-HRP/IAA对喉癌细胞具有更加明显的杀伤和放射增敏作用.
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喉癌细胞hTERT启动子介导基因治疗研究
目的 研究喉癌细胞中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶(hTERT)表达和hTERT启动子活性的关系,以及hTERT启动子介导喉癌基因治疗的可行性.方法 将含hTERT启动子的质粒转染不同放射敏感性喉癌细胞(Hep2和Hep2R),通过报告基因评价启动子活性,RT-PCR检测hTERTmRNA表达,PCR-ELISA法检测端粒酶活性.构建质粒phTERTp-HRP,用RT-PCR和酶活性分析评价辣根过氧化物酶(HRP)表达,以克隆形成实验评价phTERTp-HRP/吲哚乙酸(IAA)对克隆形成率和放射敏感性的影响.结果 Hep2R的端粒酶活性、hTERT mRNA表达水平和hTERT启动子活性分别是Hep2的1.37、1.43和1.81倍.hTERT启动子活性与hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性之间显著正相关(P＜0.01).转染phTERTp-HRP后,Hep2R细胞中HRP mRNA表达和HRP活性水平分别是Hep2细胞的2.1倍和1.8倍.0.5 mmol/LIAA处理后,SERSF2分别为1.24(Hep2R)和1.20(Hep2),无IAA和有IAA组存活曲线参数α分别为0.020、0.090(Hep2R)和0.042、0.099(Hep2).结论 hTERT启动子可用于不同放射敏感性喉癌细胞的基因治疗.hTERTp-HRP/IAA基因治疗有望用于喉癌细胞的靶向杀伤和放射增敏.
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诱导建立乳腺癌MCF-7放射耐受细胞亚株的实验研究
目的:探索诱导并建立人乳腺癌MCF-7放射耐受细胞亚株的体外实验方法.方法:体外培养MCF-7细胞株,应用梯度递增的X线对MCF-7进行诱导照射,照射剂量达到59Gy时,得到放射耐受细胞亚株(MCF-7R),扫描电镜和透射电镜观察亲本株MCF-7与放射耐受细胞亚株MCF-7R细胞超微结构,流式细胞仪检测其细胞周期分布,集落形成实验检测其放射敏感性,并计算存活分数,多靶单击模型拟合细胞存活曲线.结果:与MCF-7相比,MCF-7R外形及细胞器均出现明显改变;G2/M期比例明显降低;(13.32%vs.9.43%)放射敏感性参数SF2即照射2 Gy时的细胞存活分数升高34%(P<0.001),准域剂量Dq值由2.261 Gy升高至3.695 Gy(P<0.05),平均致死剂量Do值由1.215 Gy升高至1.834 Gy(P<0.05).结论:照射剂量梯度递增法是可行的建立人乳腺癌放射耐受细胞亚株的方法,得到的放射耐受亚株细胞形态及细胞生物学特性与亲本株细胞相比较有明显差异.
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放射耐受性结肠癌细胞亚株的建立及其生物学特性
背景与目的:结肠癌是消化系统的常见肿瘤,放疗是其重要的治疗手段之一.诱导并筛选具有放射耐受性的结肠癌细胞亚株,为研究结肠癌放射耐受的机制提供实验模型.方法:应用梯度递增剂量的γ射线对SW620细胞株进行诱导照射,筛选得到放射耐受细胞亚株SW620/R.观察细胞的形态变化和生长情况,通过CCK8法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞照射的周期及凋亡的变化,克隆形成实验检测细胞克隆形成率和放射敏感性.结果:通过照射剂量梯度递增的诱导方法,成功建立了SW620/R细胞亚株.SW620/R细胞亚株形态与亲本细胞明显不同,并且在高剂量射线照射后仍能继续生长;鉴定实验显示SW620/R细胞亚株与亲本细胞相比倍增时间明显延长,克隆形成率显著下降;在细胞周期上S期的比例显著上升,并且在照射后未出现周期的阻滞现象,同时发现其自发凋亡率显著下降;克隆形成实验显示其放射耐受性明显升高.结论:成功建立了放射耐受的细胞亚株SW620/R,经鉴定其放射敏感性显著降低,且两者在增殖、克隆形成率、细胞周期和自发凋亡上差异有统计学意义(P＜0.05).
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烧伤小鼠供体皮肤特异性延长成活研究
目的:以烧伤小鼠为模型研究供体皮肤特异性延长成活的可行性.方法:C57BL/6小鼠造成20%TBSAⅢ度烧伤创面,48h后切痂,移植BALB/c或C3H/He小鼠皮肤,经60Co射线全身照射9Gy,立即注射无T淋巴细胞的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的骨髓细胞.组Ⅰ为烧伤的C57BL/6小鼠移植BALB/c小鼠皮肤;组Ⅱ在组Ⅰ基础上行放射处理;组Ⅲ在组Ⅱ基础上行混合骨髓移植;组Ⅳ类似组Ⅲ,但移植的皮肤为C3H/He;组Ⅴ为C57BL/6小鼠同系皮肤移植对照组.结果:除组Ⅱ小鼠由于骨髓耗竭而全部死亡外,其他各组间动物死亡率无差异,未见移植物抗宿主病表现.异体皮平均成活时间组Ⅰ为(8.4±1.5)d;组Ⅱ(17.5±3.7)d;组Ⅳ(32.5±8.1)d;组Ⅲ为(78.2±5.6)d,与组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅳ比较P<0.05;组Ⅴ90d.结论:C57BL/6小鼠对BALB/c小鼠皮肤显示了特异性移植耐受,而排斥MHC不相关的C3H/He的小鼠皮肤.本研究也为进一步的临床基础研究奠定了基础.
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放疗耐受星形胶质细胞瘤的蛋白组学分析
目的 分析不同放疗敏感性星形胶质细胞瘤蛋白表达特点.方法 以放疗后预后为依据,将WHOⅡ级星形胶质细胞瘤分为放疗敏感组和耐受组.应用二维液相色谱-质谱联用法分析胶质瘤蛋白表达,鉴定两组间差异表达蛋白.对差异蛋白磷酸甘油酸激酶1进行Western blot验证.结果 磷酸甘油酸激酶1在胶质瘤放疗耐受组中过表达.结论 磷酸甘油酸激酶1增多可能与胶质瘤放疗耐受的发生相关.
