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糖原合酶激酶-3β促进卵巢癌细胞增殖的实验研究
目的 探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)对卵巢癌细胞增殖的影响及其意义.方法 以蛋白印迹法检测GSK-3β和磷酸化GSK-3β (pGSK-3β)在卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2中的表达水平;采用细胞计数法描记细胞生长曲线,以检测GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763对SKOV3和ES-2细胞生长的影响;将SKOV3细胞分成4组,将增加GSK-3β活性的质粒GSK-3βS9A及其空载体对照质粒pCS2、降低GSK-3β活性的质粒GID5-6及其对照质粒GID5-6LP,分别用电转法与绿色荧光蛋白(GFP)质粒共同转染入细胞中,采用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入实验检测GSK-3β活性对卵巢癌细胞增殖的影响;利用G418筛选瞬时转染的SKOV3细胞得到稳定转染株后,采用克隆形成实验,观察改变GSK-3β的活性对卵巢癌细胞增殖的长期影响. 结果 SKOV3和ES-2细胞均表达GSK-3β和pGSK-3β,SKOV3细胞中pGSK-3β的表达水平比ES-2细胞低,而两者GSK-3β的表达水平相近.GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763可抑制SKOV3和ES-2细胞的生长.与对照pCS2相比,转染GSK-3βS9A质粒可提高GSK-3β的活性,增加SKOV3细胞BrdU的掺入率;与对照GID5-6LP相比,转染GID5-6质粒可降低GSK-3β的活性,减少SKOV3细胞BrdU的掺入率.分别与各自的对照质粒相比,稳定转染GSK-3βS9A可形成较多的细胞克隆,而稳定转染GID5-6则形成的细胞克隆较少. 结论 GSK-3β具有促进卵巢癌细胞增殖的作用,抑制GSK-3β的活性可望成为卵巢癌治疗的新靶点.
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喹啉酸对PC12细胞自噬发生及相关信号通路蛋白表达的影响
目的：探讨喹啉酸（QA）是否引起大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬的发生及其与糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/β-联蛋白相关信号通路的关系。方法用不同浓度QA（2.5，5和10 mmol·L-1）处理PC12细胞24 h，MTT法测定细胞存活，免疫荧光法观察微管相关蛋白1轻链3（LC3）荧光斑点标记的自噬体形成，Western蛋白印迹法检测细胞GSK-3β、β-联蛋白、LC3和Beclin 1的表达。结果 QA作用24 h，可浓度依赖性地降低PC12细胞存活率，IC50为8.7 mmol·L-1。QA作用24 h，与正常对照组比较，PC12细胞内LC3荧光斑点标记的自噬体增多，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和Beclin 1表达增高（P<0.01）；同时PC12细胞内GSK-3β的表达增加（P<0.05，P<0.01），β-联蛋白的表达降低（P<0.05，P<0.01）。结论 QA可诱导PC12细胞自噬的发生，其机制可能与GSK-3β/β-联蛋白相关的信号通路激活有关。
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糖原合酶激酶3信号通路的细胞保护作用机制
糖原合酶激酶3(GSK-3)广泛发分布于人类及动物的组织细胞中,是许多信号调节通路的交汇点,与多种疾病的发生密切相关.GSK-3的两个亚型(α及β)在结构上虽然有相似之处,但是功能上有显著差异,两者的组织特异性也有不同之处.该文就GSK-3的基本结构和功能进行阐述,从GSK-3与心脏疾病、糖尿病、缺血性视网膜病及肿瘤等方面的关系概述GSK-3如何发挥细胞保护作用.
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GSK3-Wnt信号通路与糖尿病肾病的关系
Wnt信号通路参与细胞的分化、增殖和凋亡,与诸多疾病密不可分.糖原合酶激酶3(GSK3)是生物体内诸多信号通路的参与者,是Wnt信号通路的上游作用物,对其起着关键作用.糖尿病肾病的发生和发展机制复杂,在分子生物学上需要许多信号通路的参与.现就GSK3-Wnt信号通路与糖尿病肾病的关系进行总结和讨论.
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截断型载脂蛋白E4对培养神经元细胞中神经细丝磷酸化的影响
背景:神经细丝的磷酸化程度与阿尔茨海默病的发生密切相关,载脂蛋白E4是阿尔茨海默病公认的易患因子,但载脂蛋白E4对神经元细胞内神经细丝磷酸化的影响及机制尚不十分清楚.研究显示在阿尔茨海默病患者脑组织和体外培养的神经元细胞中,载脂蛋白E4蛋白C末端的272～299位氨基酸残基可被水解截去,产生truncated-apoE4片段,且与阿尔茨海默病的特征性病理改变神经纤维缠结中的磷酸化神经细丝相互作用.目的:在细胞水平观察truncated-ApoE4过度表达对培养的神经元中神经细丝磷酸化的影响.设计:非随机对照实验观察. 单位:华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系.材料:实验于2005/12在华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学实验室完成.小鼠成神经瘤贴壁生长细胞株N2a由许华熙博士提供.方法:构建pEGFp-T-apoE4真核表达重组体,采用脂质体介导的方法分别将pEGFP-c3、pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4瞬时转染小鼠成神经瘤细胞株(N2a),24～48 h后,免疫印迹技术检测神经细丝的磷酸化状态,测定糖原合酶激酶3、细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)的活性.主要观察指标:神经细丝的磷酸化程度及糖原合酶激酶3、细胞周期依赖性蛋白激酶5的酶活性.结果:转染组细胞内磷酸化神经细丝含量显著增多,糖原合酶激酶3酶活性显著增加,以pEGFP-T-apoE4转染组为显著(P＜0.05),细胞周期依赖性蛋白激酶5酶活性与对照组相比差异无显著性意义(P＞0.05).结论:Truncated-ApoE4过度表达可通过激活糖原合酶激酶3而非细胞周期依赖性蛋白激酶5引起成神经瘤细胞株(N2a)细胞中神经细丝过度磷酸化,提示truncated-ApoE4可能参与了阿尔茨海默病的病理过程.
关键词： 载脂蛋白E类 糖原合酶激酶3 细胞周期蛋白质依赖激酶类 阿尔茨海默病 -
糖原合酶激酶3β信号通路在脑缺血中的作用
糖原合酶激酶3β( glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.生长因子、Wnt等多条信号通路可抑制GSK3β活性,从而促进细胞存活.脑缺血时,随着GSK3β磷酸化水平发生改变,其上游和下游蛋白磷酸化水平也发生改变.缺血预处理和后处理可能通过调节GSK3β信号通路诱导脑缺血耐受.
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反复双侧颈总动脉闭塞小鼠海马Akt和糖原合成酶激酶-3β表达
目的 探讨反复双侧颈总动脉闭塞所致血管性痴呆(vascular dementia,VaD)小鼠海马Akt和口糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)蛋白表达.方法 48只健康雄性C57B1/6小鼠随机分为正常组、假手术组和模型组,每组16只.模型组采用反复3次间断阻断双侧颈总动脉建立小鼠VaD模型,假手术组只分离双侧颈总动脉但不阻断,正常组不接受任何处理.术后4周利用水迷宫实验和跳台实验观测各组小鼠行为学改变,采用HE染色观察海马组织病理学变化,采用蛋白质印迹法检测海马Akt、p-Akt(Ser473)、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达.结果 水迷宫实验中,模型组学习阶段和记忆阶段游完全程时间延长(学习阶段:F=19.389,P＜0.05;记忆阶段:F=27.929,P＜0.05),错误次数增加(学习阶段:F=7.228,P＜0.05;记忆阶段:F =21.189,P＜0.05)；跳台实验中,模型组小鼠学习阶段反应时间延长(F=19.162,P＜0.05)、错误次数增加(F=6.562,P＜0.05),记忆阶段潜伏时间缩短(F=10.634,P＜0.05)、错误次数增加(F=12.890,P＜0.05).同时,HE染色显示模型组海马CA1区神经元减少,神经胶质细胞增生；p-Akt(Ser473)(F=37.849,P＜0.05)和p-GSK3β(Ser9)(F=67.725,P＜0.05)蛋白表达在术后4周较假手术组显著上调,而各组间Akt(F=1.004,P＞0.05)和GSK3β(F=0.329,P＞0.05)总蛋白表达无显著差异.结论 反复双侧颈总动脉闭塞可造成小鼠学习记忆障碍,海马组织受损严重.磷酸化Akt和GSK3β表达可能参与了VaD的机制.
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缺氧预处理可能通过下调糖原合酶激酶3β和信号转导及转录激活蛋白3保护大鼠局灶性脑缺血
目的 探讨磷酸化糖原合酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β,pGSK3β)和磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,pSTAT3)在缺氧预处理保护大鼠缺血性脑损伤中的作用.方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血组和缺氧预处理组,每组20只.采用改良线栓法建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺氧预处理组大鼠在制备MCAO模型前置于模拟海拔5 000 m的低压氧舱中(压力:0.53×105 Pa;氧分压:81 mmHg,1 mmHg =0.133 kPa),每天3h,连续5d.在MCAO模型制作后24 h对大鼠进行神经行为学评分(n=6)和脑梗死体积测定(n=6),应用免疫组化染色法检测缺血皮质神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)和pGSK3β(Ser9)表达(n=7),应用蛋白质印迹法检测缺血皮质pGSK3β(Ser9)和pSTAT3(Tyr705)表达(n=7).结果 缺氧预处理组神经功能缺损评分[(1.833 ± 0.408)分对(2.667±0.516)分;t=3.101,P=0.011]和脑梗死体积[(18.137 ±0.801)％对(24.125 ±0.694)％;t=13.840,P＜0.001]均显著低于和小于脑缺血组.免疫组化染色显示,脑缺血组和缺氧预处理组NeuN阳性细胞数量均显著少于假手术组[(48.000±1.414)个/高倍视野、(124.833± 3.061)个/高倍视野和(213.500± 2.429)个/高倍视野,F=7 150.550,P＜0.001],缺氧预处理组显著多于缺血组(P＜ 0.001);脑缺血组和缺氧预处理组pSTAT3阳性细胞数量均显著多于假手术组[(57.667±1.366)个/高倍视野、(29.167±1.941)个/高倍视野和(3.500±1.049)个/高倍视野,F=1 962.649,P＜0.001],缺氧预处理组显著少于缺血组(P＜0.001).蛋白质印迹分析显示,脑缺血组和缺氧预处理组缺血皮质pGSK3β和pSTAT3表达水平显著高于假手术组[pGSK3β:(2.336±0.102)、(0.876±0.196)和(0.440±0.012),F=1 610.826,P＜0.001;pSTAT3:(8.368±0.230)、(4.883±0.123)和(0.595 ±0.138),F =4 018.051,P＜0.001],缺氧预处理组显著低于缺血组(P均＜0.001).结论 缺氧预处理对缺血性脑损伤大鼠具有神经保护作用,可能与下调pGSK3β和pSTAT3表达有关.
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糖原合酶激酶3与2型糖尿病的关系
糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3 , GSK3)于1980年被鉴定出来后,一度被认为仅仅是一个调节糖原代谢的蛋白激酶.其后,研究证实GSK3在多种细胞功能活动的调节中扮演着重要的角色.包括调节细胞的结构、细胞内的信号传导、细胞的分裂、凋亡、微管运动,甚至还参与决定胚胎发育过程.
关键词： 糖原合酶激酶3 糖原合酶激酶3抑制剂 2型糖尿病
