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人重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用
目的 探讨人类表皮生长因子受体2(Her-2)靶向重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用.方法 将抗Her-2单链抗体基因e23sFv、绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和重组型caspage-6基因连接,构建成Immunocasp-6(e23sFv-PE Ⅱ-casp-6)融合蛋白,将其亚克隆入真核表达载体pCMV中,构建pCMV-e23sfv-PE Ⅱ-caspase-6载体(简称pCMV-6).将荷瘤裸鼠随机分为治疗组和对照组,采用阳离子脂质体包裹法,将pCMV-6和pCMV分别肌肉注射入荷瘤裸鼠身上,观察肿瘤体积和裸鼠体重的变化,并称取肿瘤重量.采用HE染色法观察肿瘤组织形态学变化,采用末端脱氧核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)检测肿瘤组织的凋亡形态,采用免疫组织化学染色检测目的基因的表达.结果 对照组的肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠体重分别为(975.09±49.76)mm3、(1.08±0.16)g和(4.07±0.49)g,治疗组分别为(376.01±265.18)mm2、(0.64±0.18)g和(6.20±1.14)g.HE染色和TUNEL法检测显示,治疗组裸鼠肿瘤组织呈现出典型的凋亡特性,而对照组裸鼠肿瘤组织结构正常.免疫组织化学染色显示,caspase-6在治疗组裸鼠肿瘤组织中呈阳性,而在对照组肿瘤组织和肌肉组织中呈阴性.结论 人重组型caspase-6融合蛋白能靶向性识别、结合Her-2阳性的骨肉瘤细胞,并诱导其发生凋亡,为骨肉瘤的临床治疗提供了一定的实验基础.
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鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响
目的 研究鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响.方法 采用小鼠右后足底皮内注射5％福尔马林溶液建立疼痛模型,32只小鼠根据随机数字表法分成四组:空白组、溶媒组、低剂量组和高剂量组,每组8只.空白组仅建立疼痛模型,溶媒组、低剂量组和高剂量组分别鞘内注射20％二甲基亚砜(DMSO)、5 μg Z-VEID-FMK和10 μg Z-VEID-FMK,给药体积为5μL,随后建立疼痛模型.观察福尔马林炎性痛小鼠舔/咬脚时间,比较模型建立前及建立后60 min小鼠足底的厚度.结果 各组小鼠足底皮内注射福尔马林后均出现明显的双时相疼痛反应,在一相痛中,低剂量组[(88.88±6.98)s]、高剂量组[(90.09±8.49)s]与溶媒组[(90.50±11.18)s]小鼠舔/咬脚时间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);在二相痛中,与溶媒组[(220.25±80.80)s]比较,低剂量组[(81.25±14.10)s]、高剂量组[(50.63±10.77)s]小鼠舔/咬脚时间均显著缩短,差异有高度统计学意义(P＜0.01).与溶媒组[(1.78±0.02)mm]比较,低剂量组[(1.31±0.07)mm]及高剂量组[(1.11±0.08)mm]小鼠足底肿胀显著降低,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK可以缓解小鼠福尔马林炎性痛,可能与其抑制炎性因子作用有关.
关键词： Caspase-6 Z-VEID-FMK 福尔马林炎性痛 足底厚度 -
白藜芦醇诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中caspase-6的活化
目的:探讨白藜芦醇(Res)诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中是否有caspase-6的活化.方法:用Western-blot分析caspase-6酶原的裂解,半定量RT-PCR检测caspase-6 mRNA表达的改变,比色法测定caspase-6活性的变化.结果:用Res 0(对照)、25、50、100、200 μmol/L处理细胞24小时,caspase-6酶原的表达随药物浓度的增加而减少,100 μmol/L时开始出现活性裂解片段P20(20 kD),200 μmol/L时P20增加;caspase-6 mRNA的表达呈浓度依赖性的增加(P＜0.01);caspase-6活性呈浓度和时间依赖性的升高(P＜0.01).结论:Res诱导CNE-2Z细胞凋亡过程中有caspase-6的活化.
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橙皮苷抑制JNK信号通路辅助治疗2型糖尿病大鼠
目的 探讨橙皮苷治疗2型糖尿病大鼠后,其肝脏JNK信号通路3个关键分子JNK、P-JNK、Caspase-6表达的特点.方法 40只雄性SD大鼠,随机分为空白组(12只),模型组(14只),橙皮苷治疗组(14只),模型组和橙皮苷治疗组高脂饮食6个月形成2型糖尿病模型,治疗8周后收集肝脏行免疫组化检测JNK、P-JNK、Caspase-6分布及表达;Western blot及RT-PCR测定3个蛋白和mRNA表达.结果 免疫组化结果示橙皮苷治疗组肝细胞相应蛋白表达JNK、P-JNK、Caspase-6较模型组减少(P＜0.05),但和空白组差距仍然较大(P＜0.05);JNK、P-JNK、Caspase-6蛋白以及mRNA表达,橙皮苷组低于模型组(P＜0.05),但和对照组仍有一定的差异(P＜0.05),胰岛素抵抗指数与上述3个蛋白改变趋势一致.结论 橙皮苷可降低2型糖尿病胰岛素抵抗指数,其机制可能是通过抑制JNK信号通路中JNK、p-JNK以及Caspase-6的表达实现的.
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人重组caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞靶向促凋亡作用
目的:探讨Her 2靶向重组的caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用.方法: 将抗Her 2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和活性caspase-6 基因连接,构建成Immunocasp-6(e23sFv-PEⅡ-casp-6)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的基因表达和细胞形态学变化,通过Annexin V染色、流式细胞术、MTT法检测来观察其促肿瘤细胞凋亡的作用.结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出caspase-6的表达,SOSP-9607细胞出现明显的核浓缩、碎裂;电镜观察到细胞质浓缩,胞内空泡,核染色质浓集等典型的凋亡特征;MTT法检测发现细胞的增殖明显被抑制;Annexin V染色流式细胞术检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为31.4%,较对照组细胞(凋亡率为6.0%)有非常显著的增加(P＜0.01). 结论: 重组Immunocasp-6基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导细胞发生凋亡.
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高三尖杉酯碱诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中Caspase-6、-8的活性变化
目的了解高三尖杉酯碱(HHT)诱导CNE-2Z细胞凋亡过程中Caspase-6、-8的活性变化.方法用不同浓度(0.125、0.25、0.5、1μg/ml)的HHT分别处理CNE-2Z细胞1、2、4、8、12、24h,用比色法检测其Caspase-6、-8的活性(A405mm表示).结果1μg/ml HHT处理CNE-2Z细胞1h即可见Caspase-8活性明显高于两个对照组(未处理组和抑制剂+药物处理组,P＜0.01),2h达高峰.而Caspase-6的活性在4h开始升高,12h达高峰,24h仍明显高于对照组(P＜0.01).不同浓度的HHT处理CNE-2Z细胞,Caspase-6在12h、Caspase-8在2h时均可见它们的活性明显高于两个对照组(P＜0.01),且随HHT浓度的增加而活性增强.结论Caspase-6、-8参与了HHT诱导的CNE-2Z细胞凋亡,且其活性升高有时间和浓度依赖性.
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c-Jun在胆红素脑病幼鼠海马神经细胞凋亡中的作用
目的 探讨c-Jun在胆红素脑病幼鼠海马神经细胞凋亡中的作用.方法 选取7日龄新生SD大鼠,经小脑延髓池注射胆红素溶液(10 g/L),注射后6h、12h断头取脑,重氮反应法检测海马胆红素水平,Nissl染色观察海马神经元的病理变化;Western blot和免疫荧光染色检测c-Jun氨基末端激酶(JNK)、c-Jun及p-c-Jun的表达;ELISA实验和荧光分光光度法测定凋亡相关因子Caspase-3和Caspase-6.结果 小脑延髓池注射胆红素后幼鼠出现不同程度的异常行为学表现,6h和12 h后海马胆红素水平较对照组显著升高[(44.00±13.00)％ (P ＜0.05)和(96.86±9.00)％(P＜0.01)],24 h后海马神经元脱失,Nissl染色浅淡.随着海马胆红素水平增高,JNK蛋白表达水平(2.41 ±0.15)较对照组(1.00±0.09)增加1.4倍(P＜0.05),其下游靶分子c-Jun和p-c-Jun表达水平(1.43 ±0.16,2.16±0.23)也分别较对照组(1.00±0.13,1.00±0.11)上升0.43倍和1.16倍(P均＜0.05).免疫荧光染色结果显示,胆红素注射6h后海马及大脑皮质c-Jun和p-c-Jun阳性细胞增多.凋亡相关分子Caspase-3和Caspase-6活性在注射胆红素12 h后开始上升,24 h后分别较对照组增加2.08倍和0.28倍(P均＜0.05).结论 c-Jun蛋白磷酸化在促进胆红素诱发的幼鼠海马神经细胞凋亡中发挥重要作用.
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Caspase-3与Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌中的表达及临床意义
目的 探讨Caspase-3、Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌(RCCC)的表达及与预后的关系.方法 采用免疫组化(SP法)对75例RCCC及其癌旁组织、15例正常肾组织标本中的Caspase-3、 Caspase-6蛋白的表达进行研究,分析与RCCC临床病理特征及其术后生存率的关系.结果 Caspase-3蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组,差异有显著性(P<0.01);在病理分级中的阳性表达率G3低于G1;在临床分期中的阳性表达率Ⅲ～Ⅳ期低于Ⅰ期;在淋巴结转移阳性组中阳性表达率低于阴性组,差异均有显著性(P<0.05).Caspase-6蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组,差异有显著性(P<0.05);在不同病理分级和临床分期中阳性表达率差异均无显著性(P0.05);在淋巴结转移阳性、阴性组中的阳性表达率差异无显著性(P0.05).在RCCC中,统计学显示Caspase-3与Caspase-6蛋白表达无相关性(C=0.0921,P0.05).在35例随访患者中,Caspase-3、Caspase-6蛋白表达阳性、阴性的术后3年死亡率差异均无显著性(P0.05).结论 Caspase-3蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织,与临床分期、病理分级呈负相关,其低表达与淋巴转移有关.Caspase-6蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织,但与临床分期、病理分级及淋巴转移无关.在RCCC中,Caspase-3蛋白的表达与Caspase-6蛋白的表达无相关性.
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重构型Caspase-6对HeLa细胞凋亡的诱导作用
目的将人Caspase-6基因大小亚基顺序颠倒,表达为重构型Caspase-6分子,探讨其对细胞凋亡的促进作用. 方法RT-PCR获取人Caspase-6基因,测序判断正确后,通过重组PCR的方法构建大小亚基顺序颠倒的重构型Caspase-6(RevCasp6)基因.将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染人宫颈癌细胞系HeLa,在荧光显微镜下观察细胞形态的变化,用电子显微镜进一步观察细胞的凋亡特征. 结果获得了人Caspase-6基因,并成功地构建了大小亚基顺序颠倒的RevCasp6基因.以构建的RevCasp6真核表达载体,转染HeLa细胞后,荧光显微镜观察到细胞生长不良、细胞核结构破坏和细胞死亡.电子显微镜观察显示,转染了RevCasp6基因的细胞呈凋亡的典型特征.结论RevCasp6基因具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.
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人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达
目的:观察人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达及其对转染的Hep-2细胞的作用.方法:用RT-PCR方法获取人caspase-6全长cDNA,经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase-6(re-caspase-6,简称rcasp6).将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV,转染Hep-2细胞.用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达,HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化,细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化.结果:成功地获得了人重构型caspase-6基因(rcatsp6),并构建了真核表达载体.转染Hep-2细胞后,检测到目的蛋白的表达.倒置显微镜观察转染细胞有明显变化,培养情况下出现大量细胞固缩变小,伴随有细胞死亡.HE染色和电镜观察显示,固缩的细胞呈现凋亡的典型特征.结论:人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中表达,可使转染细胞的形态发生变化,出现大量的凋亡细胞.
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大鼠皮肤挫伤修复过程中caspase-6的表达及其时间规律性
目的 探讨皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤区及挫伤周边区不同时间表达的变化规律.方法 应用免疫组化染色、Western blot技术显示caspase-6在皮肤挫伤区及挫伤周边区炎性细胞中的阳性表达和激活情况.结果 伤后3 h,挫伤区内浸润的少量多核粒细胞的胞质中caspase-6呈弱阳性表达,阳性率为(25.78±1.38)%;伤后12h,阳性表达增强明显,阳性率为(47.70±5.14)%;伤后3d,几乎所有多核粒细胞、单核细胞和成纤维细胞中caspase-6呈强阳性表达,阳性率为(54.58±5.64)%,表达达高峰,以后逐渐下降.Westemblot实验证明,caspase-6酶原表达呈现时间规律性变化.结论 大鼠皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用;同时,caspase-6在挫伤区内多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化,可对挫伤时间的推断提供参考.
