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牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚表达的原位杂交研究
目的:探讨牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)mRNA在牙齿发育过程中的作用.方法:采用原位杂交技术,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP mRNA的表达.结果:DSPP在成牙本质细胞的表达始于钟状中期,并贯穿以后的各个时期;此阶段,它还在前成釉细胞及成釉细胞中具有一过性表达.结论:DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性;它可能在牙齿的形成中具有重要作用.
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BMP-7诱导成牙本质细胞相关蛋白在 DPSCs 中的研究
目的：检测成牙本质细胞相关功能性蛋白（DSPP、DMP-1、ALP）在 BMP-7诱导前后的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）中的表达。方法：采用电镜观察、CCK8和细胞免疫化学染色的方法，观察经100 ng／ml BMP-7诱导后的 DPSCs细胞形态、增殖和向成牙本质细胞方向分化的情况。结果：经 BMP-7诱导的 DPSCs 形态无明显变化；BMP-7诱导后第7天细胞增殖比对照组减慢。DPSCs 不表达或低表达 DSPP、DMP-1和 ALP 经 BMP-7诱导后，DSPP、DMP-1和 ALP 呈阳性表达。结论：DPSCs 经 BMP-7诱导后可以向成牙本质细胞方向分化。
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三氧化矿物凝聚体对成人牙髓干细胞增殖和分化的影响
目的:研究不同浓度的三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对成人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和分化的影响.方法:体外培养hDPSCs,分别以不同浓度MTA浸提液作用于hDPSCs.采用四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)法测定MTA对hDPSCs增殖的影响;Von Kossa染色法检测hDPSCs钙化结节的形成;通过酶标仪法检测hDPSCs碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPp)基因的表达.采用单因素方差分析对数据进行统计学分析.结果:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs增殖,其ALP活性也明显高于其他各组,并可见Von Kossa染色呈阳性,有钙化结节形成,且能明显促进牙髓干细胞表达DSPP;而20 mg/mL MTA则抑制hDPSCs的增殖,ALP活性明显低于其他各组,Von Kossa染色阴性;而0.2mg/mL MTA组及氢氧化钙组未能表现出明显的增殖分化活性.结论:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs的增殖,并能诱导hDPSCs向成牙本质细胞方向分化.20 mg/mL MTA抑制hDPSCs的增殖,并且抑制hDPSCs向成牙本质细胞方向分化.
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RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响
目的:通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18(Fibroblast Growth Factor18 ,FGF18)对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达的影响.方法:RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23,RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达,观察FGF18低表达对DSPP表达的影响.结果:瞬时转染RNA干涉质粒后,MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少,与此同时DSPP的表达量也明显减少.结论:FGF18可以调控DSPP的表达,影响成牙本质细胞的分化.
关键词： 成纤维细胞生长因子18 牙本质涎磷蛋白 MDPC-23 RNA干涉 瞬时转染 -
Cbfαl对小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子转录调控作用的研究
目的:研究Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子转录活性的影响.方法:确定Cbfa1瞬时转染的高表达时间点后,将含牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的真核表达载体与PCMV5-Cbfα l共转染MDPC-23细胞,分析Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子的转录调控作用.结果:MDPC-23细胞转染PCMV5-Cbfαl后,Cbfαl在48h时表达量高.Cbfa1表达对各段启动子都有激活作用.结论:Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子有转录激活的调控作用.
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小鼠牙本质涎磷蛋白5′端非编码区启动子报告基因载体的构建和分析
目的:克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子,构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体,在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析各种载体中DSPP启动子活性.方法:PCR、报告基因载体构建、瞬时转染和报告基因检测.结果:PCR获得DSPP启动子的3个不同片段,将它们克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,构建出3种含DSPP启动子不同片段的报告基因载体,将这些报告基因载体瞬时转染至MDPC-23细胞,载体中的启动子具有不同的活性.结论:成功构建了含小鼠DSPP启动子片段的报告基因载体,为以后研究DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具.
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遗传性乳光牙本质致病基因DSPP的突变分析
目的:就天津地区新发现的一个遗传性乳光牙本质回族家系进行牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)致病基因的突变检测,以证实是否有新的突变位点,并进一步阐明该病基因型和表型间的相互关系.方法:对该家系中的10名患者和8名正常人提取外周血DNA,针对DSPP基因外显子3和外显子4设计引物,以进行巢氏PCR扩增.PCR扩增产物经直接测序分析,或用限制性内切酶RsaI酶切鉴定.结果:测序结果显示:遗传性乳光牙本质患者DSPP基因外显子3的3658位核苷酸存在C→T的无义突变,该突变使终止密码子提前出现;RsaI酶切分析也证实:10名患者的DSPP基因发生了终止突变,所有患者在该位点均为杂合子.结论:DSPP基因无义突变可能会严重影响DSPP基因的功能,从而导致牙本质发育不全.
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小鼠牙本质涎磷蛋白启动子报告基因载体的构建和启动子活性分析
目的: 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoproteinDSPP)基因启动子构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析各种载体中DSPP启动子活性.方法:细胞基因组提取PCR、瞬时转染和报告基因检测.结果:从MDPC-23细胞基因组中克隆出长为1.5 kbp的DSPP启动子将启动子酶切成不同的片断克隆到虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer构建出4种含DSPP启动子不同片段的报告基因载体将这些报告基因载体瞬时转染至MDPC-23细胞载体中的启动子具有不同的活性.结论:成功构建了含小鼠DSPP启动子片段的报告基因载体为以后研究DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具.
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牙本质涎磷蛋白反义核酸对体外培养牙胚发育、矿化的影响
目的: 探讨牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)在牙胚发育及矿化中的作用.方法:胎龄为17 d Balb/c胎鼠上颌第一磨牙对照牙胚置于无血清BGjb半固定培养基中培养;其余牙胚分别置于含有30 μmol/L长15 bp的DSPP反义或正义寡核苷酸的BGjb半固体培养基中培养.牙胚体外培养16 d后分别进行HE和von Kossa检测.结果:体外培养16 d后对照组和正义组牙胚生长良好大小和形态相似.von Kossa染色显示沿牙本质基质走向有明显的矿化线;而反义组牙胚体积明显小于对照组且在根方上皮根鞘转折处上皮细胞分化程度低于对照组.von Kossa染色为阴性.结论:本研究用直接的实验结果说明DSPP反义核酸可以影响牙胚的生长抑制牙胚的矿化.研究证实:DSPP在牙齿矿化中起着重要作用.同时研究结果还提示:DSPP在维持牙齿的正常生长中也起着重要的作用.
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小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆
目的：从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因(dentin sialophosphoprotein,DSPP)。方法：采用RT-PCR方法，从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段，将所得片段装入载体pGEM-T Easy Vector进行序列测定。结果：从两种组织中均获得719bp的特异性片段。序列分析表明，与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论：成功地从小鼠牙胚、软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示：除牙齿组织外，DSPP还可在软骨中表达，它可能并非是检测成牙本质细胞的特异性指标。
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牙本质涎磷蛋白在小鼠牙齿发育中的表达
目的:通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达情况,探讨其在牙齿发育过程中的作用.方法:采用免疫组织化学染色技术,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达.结果:DSPP的蛋白表达始于钟状中期,在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达,牙体组织形成开始,则转至成牙本质细胞,直至牙冠硬组织完全形成.此阶段在成釉细胞有反复表达.牙齿萌出时,该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性.结论:DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性;它可能在牙冠硬组织的形成,牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用.
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牙本质涎磷蛋白的研究进展
牙本质涎磷蛋白及其蛋白剪切产物—牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白是在牙本质发育、矿化中起重要作用的非胶原蛋白.关于牙本质涎磷蛋白的结构、功能、表达以及翻译后修饰等均有大量的研究,使之对牙本质涎磷蛋白的认识不断深入.本文就近年来关于牙本质涎磷蛋白的研究现状作一综述.
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早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究
目的：初步探讨牙本质涎磷蛋白（de ntin sialophosphoprotein，DSPP）在早期牙髓损伤修 复中的作用。方法：制备大鼠牙髓损伤模型，分别对损伤后6h、12h ，1d，2d，3d，7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色，检测各实验组标本中DS PP的表达。结果：正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳 性着色;牙髓损伤后6h，12h，DSPP在成牙本质 细胞层的染色明显减弱；损伤后1～3d，染色较正常牙增强。此时，牙尖及富细胞区的牙髓 细胞也有阳性着色；损伤后7d，染色与正常对照无明显差异。结论：DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调；随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增 强；7d时表达趋于正常。提示：它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。
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牙本质涎磷蛋白GO代转基因小鼠的获得
目的:构建四环素调控性牙本质涎磷蛋白(DSPP)转基因体系中的受控小鼠系.方法:从质粒pBluescript-DSPP中,将小鼠DSPP编码序列亚克隆到pTRE2的NotI/SalI位点间,构建转基因载体,经酶切鉴定和测序确认后,命名为pTRE2-DSPP;将XhoI酶切线性化的载体DNA纯化后,显微注射到小鼠受精卵的雄原核中,挑选生长状态好的受精卵,移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生3 wk后,用PCR及SouthernBlot检测阳性小鼠.结果:注射的受精卵共存活657枚,移卵至28只假孕母鼠后,产仔85只,PCR检测10只为阳性,Southern Blot检测6只为阳性.Southern Blot检测阳性小鼠分别传代,开始建系.结论:显微注射方法获得了DSPP转基因受控小鼠的GO代.
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小鼠牙髓干细胞培养及诱导分化
目的: 分离、培养小鼠牙髓干细胞并诱导分化. 方法: 采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液,细胞密度调整为1×104 /孔细胞,用200 mL*L-1胎牛血清的α-MEM培养液培养14 d,挑出细胞克隆消化传代,TGF-β、BMP2、bFGF细胞因子诱导,PCR检测DSPP的mRNA的表达. 结果: 小鼠牙髓细胞呈集落状生长, 克隆形成率为 1.6-2.5个/104细胞,所形成的集落细胞结合紧密,细胞体积小、胞核大,经细胞因子刺激后的细胞表达DSPP的mRNA. 结论: 培养的小鼠牙髓集落状生长的细胞具有干细胞增殖快等特性,细胞因子可诱导小鼠牙髓干细胞定向分化.
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人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达
目的克隆人牙本质涎磷蛋白(DSPP)成熟肽编码区基因片段并进行原核表达. 方法用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA, 然后利用PCR法,从cDNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段(约600 bp), 将所得基因片段插入pBluescript质粒载体,转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA, 通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆;将DSPP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达. 结果酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致,DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达. 结论克隆到人DSPP成熟肽编码区基因片段,并在原核中得到表达,为进一步研究其功能奠定基础.
