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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究
聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因，克隆至真核表达载体Pvr1012中，构建HBV X基因重组表达载体Pvr1012-X；以该质粒转染HepG2细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达；与报告质粒Psv-lacZ共转染HepG2细胞，用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒Pvr1012-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白，共转染实验中Pvr1012-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3.2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。
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乙肝病毒X基因对肝癌Bel7402细胞ras基因表达的影响
目的 探讨乙肝病毒X基因(HBx)对人肝癌细胞原癌基因ras表达水平的影响.方法 将pcDNA3.1载体与HBx基因连接构建真核表达载体pcDNA3.1-HBx,采用脂质体介导转染人肝癌细胞Bel7402,以转染空载体poD-NA3.1的Bel7402细胞为对照,于转染后2、4、8、16h收集细胞,提取细胞总蛋白并用Western blot技术检测肝癌细胞内n-Ras蛋白表达水平.结果 与转染空载体pcDNA3.1的Bel7402对照组相比,转染重组表达载体pcD-NA3.1-HBx的Bel7402细胞Ras蛋白表达水平在第2小时明显降低,第4小时Ras蛋白的表达水平仍有降低趋势,但比第2小时表达量有所增加;第8小时和第16小时,Ras蛋白的表达水平与对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HBx对人肝癌Bel7402细胞Ras蛋白表达有明显影响,HBx持续表达可能对Ras表达有促进作用.
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乙肝病毒X基因诱导肝细胞脂肪变性作用机制的研究
目的 探讨沉默肝X受体α(liver X receptorα,LXRα)基因对HepG2.2.15细胞脂质代谢相关基因表达的影响.方法 设立空白对照组(不转染任何质粒)、阴性对照组(转染阴性HK质粒)和shLXRα转染组(转染shLXRα质粒).构建针对LXRα基因的shLXRα质粒并转染HepG2.2.15细胞,用荧光显微镜及蛋白质印迹法检测转染质粒24～96 h绿色荧光蛋白和LXRα蛋白的表达以确定质粒的佳干扰时间,根据结果给予激动剂T0901317刺激细胞,用三酰甘油(TG)含量检测肝细胞脂肪变性程度,RT-PCR检测固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测乙肝病毒X(hepatitis B virus X,HBx)蛋白及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)蛋白的表达.结果 成功构建shLXRα质粒并转染HepG2.2.15细胞.与空白对照组和阴性对照组比较,shLXRα转染组LXRα蛋白表达下降,于转染后48～72 h表达低,差异有统计学意义(P＜0.01)；随着激动剂T0901317处理时间延长,各组HBx和FAS蛋白表达、TG含量、SREBP-1c mRNA水平均逐渐增加,同一时间点HBx蛋白在各组差异无统计学意义(P＞0.05),而FAS蛋白、TG含量、SREBP-1c mRNA水平,在shLXRα转染组中的表达较空白对照组和阴性对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HBx对脂代谢的调控可能部分通过LXRα/SREBP-1 c/FAS途径实现.
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HBX蛋白、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶-9在肝细胞癌组织中的表达及意义
目的 探讨乙肝病毒X(HBX)蛋白、骨桥蛋白(OPN)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达在肝癌发生、发展中的作用.方法 采用免疫组化法检测49份原发性肝细胞癌(HCC)组织及癌旁组织与10份正常肝组织中HBX蛋白、OPN、MMP-9的表达.结果 三者在癌组织、癌旁组织中阳性率均明显高于正常肝组织(P均＜0.05),均呈线性相关,癌组织转移者高于无转移者(P＜0.05).结论 HBX蛋白、OPN、MMP-9高表达可促进HCC的发生、发展与转移.
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稳定表达HBx基因的HepG2细胞对顺铂敏感性的变化及其机制研究
目的探讨乙肝病毒x基因(HBx)对肝癌细胞株HepG2化疗敏感性的影响及其机制.方法1.构建HBx的真核表达载体;2.脂质体法转染HepG2,G418筛选得到稳定表达HBx-ORF的阳性细胞克隆;3.Western blot法检测转染前后磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERKl/2)的表达变化;4.MTT法检测转染前后HepG2对顺铂的反应,以及用PD98059特异性阻断ERK1/2激活通路后HBx+HepG2对顺铂敏感性的变化.结果1.稳定表达HBx-ORF的HepG2中p-ERK1/2的表达明显强于阴性细胞;2.稳定表达HBx-ORF的HepG2在2μg/ml顺铂作用24小时后,顺铂对其抑制率为19.45%±2.50,明显低于阴性组的33.15%±2.85和转染空质粒组的30.79%±2.66(P＜0.05);用PD98059阻断阳性细胞中ERK1/2的激活之后,相同剂量,时间作用下,对HBx+HepG2的抑制率上升至32.28%±4.22,明显高于阻断前(P＜0.05).结论HBx通过ERK通路介导肝癌细胞的抗化疗反应,ERK通路有可能成为乙肝后肝癌辅助治疗的靶点.
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乙型肝炎病毒X基因的蛋白产物对HLA-DR表达的效应
目的了解HBV X基因蛋白产物对HLA-DR表达的效应.方法用野生型HBV X基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒pWHXⅡ转染HepG 2细胞.用PCR、Southern印迹、ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBV X蛋白.将带重组质粒pWHXⅡ的HepG 2细胞的和带有HBV全基因组的2.2.15细胞,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测.结果在转染的HepG 2细胞和2.2.15细胞表面均清晰地显示有HLA-DR表达,而对照组即不带质粒或只带载体质粒的HepG 2细胞则用同法不能在其表面检出HLA-DR的存在.结论证明HBV X蛋白能在无炎症和外界因素存在下,单独诱导HLA-DR的表达,提示HBV X蛋白有参与乙肝免疫反应机制的可能性.
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叶下珠提取物抗乙肝病毒及乙肝病毒X基因的研究
目的:研究叶下珠提取物在体外抗HBV以及抑制HBX表达的作用.方法:选用2.2.15细胞以及建立HepG2X、HepG2X-HIV-1-LTR-luciferase细胞系,用不同浓度的叶下珠药液进行细胞培养试验.确定药液对试验细胞的药物大无毒浓度(TC0)以及半数药物有效浓度(IC50).实验时,将细胞分空白对照组、HepG2CAT-HIV-1-LTR-luciferase细胞对照组,以及不同药物浓度的试验组(15 mg/ml,7.5 mg/ml,3.75 mg/ml),并以β-action作为内参照.用real time-PCR、RT-PCR,以及抑制荧光素酶(luciferase)等方法,定量检测HBV DNA含量以及HBX表达量.结果:叶下珠提取物大无毒剂量是15 mg/ml,对HepG2.2.15细胞HBV DNA和HepG2-X细胞HBX半数有效量皆为3.75 mg/ml(P＜0.05),而7.5 mg/ml、15 mg/ml剂量与空白对照组相比较,分别为P＜0.01,P＜0.001.对HBX的抑制荧光素酶试验,叶下珠对细胞对照组及空白对照组抑制不明显,而高剂量用药组(15 mg/ml),用药72小时与24小时比较,抑制率上升了10倍.结论:叶下珠不仅对全基因的HBV有抑制作用,还可能直接对X基因表达有抑制作用.
关键词： 叶下珠/药效学 肝细胞癌 乙肝病毒脱氧核糖核酸 乙肝病毒X基因 -
细胞外信号调节激酶通路在乙肝病毒X基因改变肝癌细胞化疗敏感性中的作用
目的 观察细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路在乙肝病毒X基因(HBx)改变肝癌细胞HepG2对顺铂敏感性中的作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pCP10质粒中扩增482 bp HBx的开放读码框(ORF),构建表达载体pcDNA3-HBx并进行酶切及测序鉴定.应用脂质体将其转染HepG2,50 mg/L G418筛选阳性克隆,抽提mRNA,逆转录(RT)-PCR鉴定是否稳定表达HBx.Western blot法检测转染前后44×103及42×103磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达.噻唑蓝(MTT)法检测转染空脂质体组、空载体组HepG2、HBx+ HepG2对2 mg/L顺铂敏感性的差异,以及顺铂联合ERK通路特异性抑制剂PD98059对HBx+HepG2抑制率的改变.结果 从pCP10中扩增得到482 bp HBx-ORF片段.将其与pcDNA3连接后经酶切及测序鉴定,成功构建HBx-ORF表达载体.从G418抗性细胞克隆中成功扩增出482 bp HBx-ORF,表明转染后的HepG2细胞稳定表达目的片段.经Western blot及灰度扫描鉴定,HBx+细胞中p-ERK蛋白表达是空脂质体组的1.97倍,是空载体组的1.67倍.MTT法检测2 mg/L顺铂作用24 h,对HBx+ HepG2的抑制率为19.56％,明显低于对空脂质体组和空载体组HepG2的抑制率(35.21％和30.18％).而先以100 μmol/L PD98059孵育2h的HBx+ HepG2,顺铂对其抑制率上升至31.20％,与未加PD98059时比较有显著提高(P＜0.05).结论 ERK信号传导通路的激活在抑制HBx+的肝癌细胞的化疗敏感性方面起重要作用,对该通路的特异性抑制有助于提高HBx+肝癌的化疗效果.
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乙肝病毒HBx-d382与HBx-d431突变体特异性抗体检测方法的建立及临床应用
目的建立检测乙肝病毒X基因突变体HBx-d382和HBx-d431特异性抗体的方法，探讨其在诊断HBV相关性肝细胞癌中的应用价值。方法通过生物信息和多肽合成的方法，制备HBx-d382和HBx-d431特异性多肽抗原。采用间接ELISA法对正常人和慢性乙肝病毒感染者和肝细胞癌病人血清中抗HBx-d382和抗HBx-d431特异性抗体进行检测。结果肝细胞癌病人血清中抗HBx-d382和抗HBx-d431抗体的阳性率均高于正常人、慢性乙肝病毒感染者(P<0.05)，慢性乙肝病毒感染者抗HBx-d382和抗HBx-d431抗体的阳性率高于正常人(P<0.05)。慢性乙肝病毒感染者HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)模式抗HBx-d382阳性率明显低于HBsAg (+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式和HBsAg(+)/HBcAb(+)模式(P<0.05)，而抗HBx-d431和抗HBxP阳性率在这些血清学模式之间无显著性差异(P>0.05)。结论抗HBx-d382和抗HBx-d431是乙肝病毒感染的一种特异性抗体，可以用于HBV携带者及慢性乙肝病人的监测，对预测肝细胞癌的发生有一定的意义。
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MiR-205-5p对HepG2.2.15细胞增殖及乙肝病毒X基因表达的影响
目的:探讨miR-205-5p对HepG2.2.15细胞增殖及HBx基因表达的影响.方法:将miR-205-5pmimics用LipofectamineTM 2000转染HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR检测转染后细胞中miR-205-5p与HBx、E2F1 mRNA相对表达量,ELISA法检测HBxAg蛋白表达量,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot检测E2F1蛋白表达.结果:miR-205-5p mimics转染HepG2.2.15细胞后,细胞增殖能力被抑制(P＜ 0.05),G0/G1期细胞增加、S期细胞减少(P＜0.05),细胞中HBx mRNA及上清液中HBxAg含量下降,E2F1mRNA及蛋白表达降低(P＜0.05).结论:miR-205-5p可能通过下调E2F1的表达来抑制HepG2.2.15细胞增殖,并可抑制HBx基因表达.
关键词： miR-205-5p HepG2.2.15 细胞周期 乙肝病毒X基因 -
乙肝病毒X基因转基因树鼩模型的建立和病理学研究
目的:探索以精原细胞作为载体建立带乙肝病毒X基因的树鼩转基因动物模型的可行性.方法:首先构建带乙肝病毒pcDNA3.1- HBx基因的表达载体;然后以脂质体2000包被之.将此复合物以微量注射器注入8只雄性树鼩之睾丸组织中,1周后重复注射1次.注射后6周,使处理过的雄树鼩与雌性树鼩交配.在仔树鼩出生后1个月,取其肝组织作活检,并以多聚酶链式反应(PCR)对其DNA表达进行鉴定,观察其内是否存在乙肝病毒X基因.结果:处理的8只雄性树鼩中,6只具有生育能力,产仔树鼩11只.其中,1只仔树鼩乙肝病毒X基因阳性(阳性率9.09%).基因测序结果证实为乙肝病毒X基因.病理检查结果显示仔树鼩肝组织的改变包括:肝细胞坏死、慢性炎细胞在汇管区的浸润.结论:以精原干细胞作为载体,建立带乙肝病毒X基因的树鼩转基因动物模型是可行的.
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HBV-X突变与TGF-β1致肝细胞肝癌相关性分析
目的:探讨乙肝病毒X区基因 (hepatitis B virus X gene, HBV-X) 变异情况与慢性乙肝病毒 (hepatitis B virus, HBV) 感染患者血清中转化生长因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1) 表达致肝细胞肝癌间的相关性.方法:收集2015年1月至2016年10月期间重庆医科大学附属第二医院的慢性乙型病毒性肝炎患者血清35例, 肝硬化35例, 肝癌35例.采用聚合酶链反应方法 (polymerase chain reaction, PCR) 扩增HBV-X基因序列, 并对其产物行DNA测序, 将测序结果与已知HBV-X基因序列对比分析变异位点.酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 检测患者血清中TGF-β1浓度.将结果进行卡方检验、单因素方差分析等方法处理数据.结果:TGF-β1浓度在肝癌组表达明显高于非肝癌组, 差异具有统计学意义 (P＜0.05) .肝病患者血清中常见的突变位点依次为:A1762T/G1764A、T1719C、G1635A、A1605G、C1653T、T1753G, 其中A1605G、A1762T/G1764A、T1753G突变率在肝癌组明显高于非肝癌组, 差异具有统计学意义 (P＜0.05) .采用t检验对两者进行分析发现, 3个位点突变与不突变组的TGF-β1浓度存在统计学差异.结论:HBV-X基因中的T1753G、A1605G、A1762T/G1764A位点突变可能与TGF-β1表达及肝癌的发生相关, 这可能参与了肝癌疾病发展进程.
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乙肝病毒X基因参与肝细胞脂肪变性的作用及机制的初步研究
目的 探讨沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞脂质代谢相关基因表达的影响.方法 设立空白对照组(HepG2.2.15细胞)、阴性对照组(HepG2.2.15细胞转染阴性HK质粒)、shHBx转染组(HepG2.2.15细胞转染shHBx质粒)和HepG2组(HepG2细胞).构建针对HBx基因的shHBx质粒,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜及Western blot检测转染质粒24～96 h绿色荧光蛋白和HBx蛋白的表达以确定质粒的佳干扰时间,根据结果予油酸钠刺激细胞,甘油三酯(TG)检测细胞脂肪变程度,RT-PCR检测固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)mRNA的表达,Western blot检测肝X受体α(liver x receptor alpha,LXRα)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)蛋白的表达.结果 成功构建shHBx质粒并转染HepG2.2.15细胞；与空白对照组和阴性对照组比较,shHBx转染组HBx蛋白表达明显下降,于转染后48～72 h表达低[(0.337±0.042)vs(0.577±0.032),(0.333±0.032)vs(0.654±0.049),P＜0.01],差异有统计学意义；随着油酸钠处理时间延长,各组TG含量、SREBP-1c mRNA水平、LXRα和FAS蛋白表达均逐渐增加,与空白对照组和阴性对照组比较,同一时间点,shHBx转染组和HepG2组中表达较低[TG:(26.51±1.98) μg/mgvs(37.16±6.32) μg/mg;SREBP-1c:0.418±0.051vs0.516±0.037;LXRα:0.463±0.047vs0.630±0.026;FAS:0.463±0.047vs0.630±0.017,P＜0.01],差异有统计学意义,而shHBx转染组与HepG2组相比水平近似,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HBx在HepG2.2.15细胞脂变中具有重要作用,可能通过调节LXRα、FAS、SREBP-1c表达影响肝细胞脂代谢.
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siRNA沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞MMP-9表达的影响
目的 利用siRNA技术探讨HBx基因沉默对肝癌细胞HepG2.2.15中MMP-9表达的影响.方法 将针对HBx基因的干扰质粒载体pSIHBV/X转染肝癌细胞HepG2.2.15,用Real-time PCR法检测HBx与MMP-9 mRNA表达；Western blot方法检测MMP-9蛋白表达.结果 Real-time PCR检测结果显示,转染24h、48 h、72 h后实验组HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA相对表达水平分别为121.13±8.72、83.17±7.93、56.33±6.17,与对照组相比(137.28±12.33)差异有统计学意义(P＜0.01)；24 h、48 h、72 h实验组HepG2.2.15细胞中MMP-9基因mRNA相对表达水平分别为83.27±6.17、69.37±8.26、58.18±4.77,与对照组相比(131.27±16.28)差异有统计学意义(P＜0.01)；Western blot检测结果表明,24 h、48 h实验组HepG2.2.15细胞中MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.357±0.025、0.218±0.051,与对照组相比(0.475±0.073)差异有统计学意义(P＜0.05).结论 利用HBxsiRNA干扰质粒沉默HepG2.2.15细胞中HBx基因表达,可下调与肿瘤细胞迁移相关的MMP-9基因mRNA水平和蛋白水平的表达.
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乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响
目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.
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用精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究
目的探讨精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性.方法构建乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X;应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达载体直接注入C57BL/6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内,于第一次注射后6周,与雌鼠交配,用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的pX蛋白.结果测序结果与文献报道一致,并且X基因在Hela细胞中表达;共产仔鼠16只,其中1只为阳性仔鼠,阳性率为6.25%.结论初步证明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的.
