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HHV-6和VEGF-C在口腔鳞癌组织中的表达及其相关性
目的 探讨人类疱疹病毒6型(HHV-6)和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)mRNA及其蛋白表达水平与口腔鳞癌的关系,初步探讨HHV-6感染与VEGF-C表达水平的关系.方法 用实时定量PCR技术和免疫组织化学方法检测口腔鳞癌组织中HHV-6和VEGF-C mRNA及其蛋白的表达水平.结果 口腔鳞癌组织中HHV-6和VEGF-CmRNA及其蛋白表达水平显著高于正常口腔组织(P＜0.05);在相同口腔鳞癌组织中HHV-6与VEGF-C mRNA的表达水平显著正相关(P ＜0.001);口腔鳞癌组织中HHV-6和VEGF-C的表达水平与淋巴结转移具有显著相关性(P＜0.05).结论 口腔鳞癌的发生与HHV-6的感染有关,其感染可能引起VEGF-C的高表达.
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胎儿巩膜碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β表达的研究
目的 观察不同胎龄胎儿眼球巩膜碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGF-β)的表达情况,了解bFGF和TGF-β在正常眼球发育过程中的作用及变化规律.方法 收集12～20周米非司酮配伍米索前列醇或利凡诺羊膜腔注射引产的胎儿20例,其40只眼,立即摘除眼球,取4～5mm范围巩膜,用实时定量PCR方法检测巩膜bFGF和TGF-β的表达情况.结果 各胎龄阶段巩膜bFGF均有表达,胎龄12～14周时表达高.以后逐渐下降并保持稳定水平,各胎龄阶段巩膜均有TGF-β表达,胎龄12周时表达较低,以后逐渐升高并保持稳定水平.结论 各胎龄阶段胎儿巩膜均有bFGF和TGF-β的表达,bFGF和TGF-β的表达水平随着胎龄的变化而变化.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 转化生长因子β 后巩膜 实时定量PCR 胎儿 -
大鼠体神经-内脏神经吻合再生后脊髓前角异体神经元的分离和凝集素的表达变化及作用
目的 研究大鼠体神经-内脏神经吻合以及体神经-体神经吻合再生后,凝集素(agrin)在脊髓前角运动神经元中的表达及其差异,探讨异体神经再生中参与突触形成和维持的相关因子.方法 建立大鼠体神经-内脏神经吻合动物模型和体神经-体神经吻合动物模型,通过荧光染料逆行追踪、标记L4脊髓前角支配盆神经节的运动神经元(异体神经元).流式细胞仪分选被标记细胞,用实时定量PCR测定分选细胞中agrin的mRNA水平.用荧光染料顺行追踪结合免疫荧光标记盆神经节处的新突触.结果 模型鼠吻合再生4个月后,体神经能够再生并替代内脏神经长入盆神经节,并终形成新的突触结构.在激光共焦显微镜下观察到了这种结构.应用荧光染料逆行追踪结合流式细胞分选技术能满意分离出L4脊髓前角的运动神经元.实时定量PCR测得agrin在各组分选神经元中均有表达,模型组中agrin表达水平较模型对照组和正常组有少许降低(P＜0.05).结论 异体神经再生长入盆节后能够形成新的突触结构,agrin参与形成和维持这种突触结构,其表达量的少许下调,可能与支配的靶器官改变而引起相应内环境的改变有关.
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突触后密度蛋白-93在大鼠脊髓损伤后的表达变化
目的 探讨突触后密度蛋白-93(PSD-93)在脊髓损伤(SCI)后的表达变化以及定位情况.方法 使用改良Allen法制备大鼠急性脊髓损伤模型,致大鼠脊髓(T9、T10)重度撞击伤.采用实时定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting测定损伤后各时间段PSD-93 mRNA及其蛋白水平在脊髓中的表达变化.采用免疫荧光双标方法检测PSD-93在正常脊髓中的分布以及损伤后的定位改变.结果 PSD-93 mRNA水平在SCI后呈现逐渐下降的趋势,在3d降到低水平;蛋白水平则在SCI后显著上调,于1d达高峰.免疫荧光双标显示,PSD-93在SCI后除与神经型一氧化氮合酶(nNOS)存在着共定位之外,还高表达于损伤局部活化的小胶质细胞和星形胶质细胞.结论 脊髓损伤后PSD-93在基因和蛋白水平呈现明显的时相变化,并且与nNOS、活化的胶质细胞存在共定位,提示PSD-93参与了脊髓继发性损伤过程.
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miRNA-181b在氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤中的作用及对热休克蛋白A5表达的调节
目的 探讨miR-181b在氧糖剥夺(OGD)致N2As神经瘤细胞缺血损伤中的作用,及其对热休克蛋白(HSP)A5表达的调节.方法 应用N2A细胞OGD模型模拟神经细胞缺血损伤,MTT比色法检测N2A细胞生存率,免疫印迹法检测HSPA5蛋白表达水平,实时定量PCR法检测miR-181b和HSPA5 mRNA表达水平,荧光素酶报告基因技术检测miR-181b对HSPA5 mRNA的直接调控作用.结果 miR-181b在OGD致N2A细胞缺血损伤中表达水平明显降低(n=5);在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的生存率(n=6);而在非OGD条件下,miR-181b表达水平的改变对N2A细胞活力无影响;miR-181b表达水平的改变可显著影响HSPA5蛋白表达水平(n=3),而非HSPA5的mRNA水平;共转染miR-181b前体(premiR-181b)或miR-181b抑制剂(anti-miR-181b)可显著抑制或增高含有HSPA5 mRNA 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性(n=5).结论 miR-181b通过负性调节HSPA5的蛋白表达水平,在OGD致N2A神经细胞缺血性损伤中发挥重要作用.
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猪脂肪源间充质干细胞诱导成脂分化及Krüppel样因子2的表达
目的 旨在阐明猪脂肪源间充质干细胞(AMSCs)在诱导成脂分化过程中Krtüppel样因子2(KLF2)的表达模式.方法 采用Ⅰ型胶原酶消化法处理猪脂肪组织,经原代和传代培养分离、纯化和扩增AMSCs,用流式细胞仪检测AMSCs纯度,在倒置显微镜下用形态学和油红O染色法检测AMSCs的成脂分化,用实时定量PCR检测KLF2的表达模式,并与过氧化物酶体增殖物激活受体2(PPARy2)的表达进行了比较.结果 分离、纯化的AMSCs,其间充质干细胞表面抗原CD29、CD44和CD105表达量分别为91.7％、95.1％和95.6％,而造血干细胞表面抗原CD34表达量仅为3.39％;在诱导分化2d后,个别细胞质中出现小脂滴,且含脂滴的细胞数量和脂滴量随诱导时间的延长而增加,在诱导分化第18天成脂分化率达48.2％;在诱导分化第2天、第8天和第16天,KLF2的表达量分别为1.84±0.206、1.07±0.072和0.83±0.095,而PPARy2 mRNA的表达量分别为3.06±0.542、13.22±0.5736和15.11±1.073.结论 获得纯度较高的AMSCs,具有良好的成脂分化潜能,KLF2的表达量在成脂分化早期的前脂肪细胞阶段增加,成脂分化开始后逐步减少,KLF2作为脂肪分化负调控转录因子而发挥作用.
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低温保存脂肪间充质干细胞的生物学特性评价
目的 探讨低温保存对小鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)体外培养的生物学特性和分化潜能的影响.方法 分离、培养小鼠ADMSCs,取第3代细胞置于液氮深低温(-196℃)冻存12个月后复苏.MTT法测定ADMSCs的增殖活性;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老;免疫细胞化学方法检测细胞表面分子CD73、CD90和CD105;条件培养基诱导后,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白(cTnT),茜素红、碱性磷酸酶和油红O染色检测成骨、成脂诱导分化潜能,Real time-PCR检测cTnT、Gata4、Ost和Runx2.未经低温保存的第3代ADMSCs为对照.结果 低温保存的ADMSCs其增殖活性、衰老率与未冻存细胞比较差异无显著性(P＞0.05).诱导后ADMSCs的cTnT阳性表达、茜素红、碱性磷酸酶和油红O染色呈阳性反应,冻存组与对照组比较差异无显著性(P＞0.05).结论 低温保存对ADMSCs体外生长特性和成心肌、成脂肪细胞、成骨细胞的分化潜能差异无显著性.
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人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞连续移植中对延缓细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB信号轴的关系
目的 探讨人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞(HSC/HPC)连续移植中对抗细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB(SIRT6/NF-κB)信号轴的关系.方法 免疫磁性分选法分离纯化雄性供体小鼠干细胞抗原阳性(Sca-1+)HSC/HPC,连续移植3代构建HSC/HPC衰老体内模型.60Co γ射线致死剂量辐射雌性受体鼠后分4组,照射对照组;衰老模型组;Rg1治疗衰老组;Rg1预防衰老组.造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色分析Rg1体内调控Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用.实时定量PCR及Western blotting检测衰老调控分子SIRT6、NF-κB mRNA及蛋白的表达.结果 连续移植后受体鼠Sca-1+ HSC/HPC出现细胞衰老特征,随移植代数的增加,Sca-1+ HSC/HPC G0/G1期细胞比例及SA-β-Gal染色阳性率增高,CFU-Mix数量下降.与同代衰老模型组相比,Rg1治疗衰老组及Rg1预防衰老组受体鼠Sca-1+ HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率下降,CFU-Mix数量升高;SIRT6 mRNA及蛋白表达上调,NF-κB mRNA及蛋白表达下调;Rg1预防衰老组各指标变化均较Rg1治疗衰老组明显.结论 Rg1可能通过调控SIRT6/NF-κB信号轴发挥其对抗连续移植过程中Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用.
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GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表达及其作用
目的 通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达及其与胚胎质量之间的相关性,探讨GRIM-19在小鼠植入前胚胎发育中的作用.方法 采用实时定量PCR,检测小鼠植入前胚胎(2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚)中GRIM-19 mRNA水平(n=16)；将小鼠8-细胞期胚胎按卵裂球大小、形态、透明带、胞质碎片分为优胚组和非优胚组,分别检测两组胚胎GRIM-19mRNA水平,并分析其相关性(n=13)；制作假孕鼠(23只),并随机分为A组(12只)和B组(11只),采用移植器将优质和非优质8-细胞期胚胎移入假孕鼠的子宫内,观察两组雌鼠妊娠率及产仔率.结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势.优质8-细胞胚胎的GRIM-19 mRNA水平明显高于非优胚组(P＜0.05).两组8-细胞胚胎移植后,A组雌鼠妊娠率及产仔率显著高于B组雌鼠(P＜0.05).结论 小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而变化,且与胚胎质量密切相关.
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MiR-100对肝癌细胞有丝分裂阻滞及Polo样激酶1蛋白表达的作用
目的 探讨microRNA-100(miR-100)对肝癌细胞有丝分裂阻滞及Polo样激酶1(PLK1)表达的作用.方法 采用实时定量PCR和免疫荧光方法检测miR-100和PLK1在人肝癌细胞HepG2中的表达.利用Oligofectamine脂质体介导将Cy3荧光标记的miR-100模拟物瞬时转染HepG2细胞,分析细胞有丝分裂和PLK1蛋白表达情况.结果 肝癌细胞HepG2的miR-100表达量低于正常肝细胞,而PLK1 mRNA和蛋白表达却异常升高.在miR-100模拟物转染后48h,实验组细胞有丝分裂指数显著小于对照细胞,经Western blotting分析显示,实验组细胞PLK1蛋白表达水平较对照组细胞均显著减低.同时免疫细胞化学检测发现,在有丝分裂中晚期和末期位于细胞核内的PLK1蛋白基本消失.结论 miR-100具有抑制PLK1蛋白表达的作用,可引起肝癌细胞有丝分裂阻滞.
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新月体型肾小球肾炎中肝X受体α的表达及意义
目的 探讨肝X受体α(LXRα)在大鼠新月体型肾小球肾炎(GN)的表达及意义.方法 7周龄Wistar Kyoto雄性大鼠40只随机分为两组.其中20只静脉注射兔抗大鼠肾小球基底膜抗体构建新月体型肾小球肾炎模型,20只作为正常对照.于注射抗体后第3、7、14、28和49天分别测定24h尿蛋白;免疫组织化学法检测第3、14、28和49天肾炎组和对照组大鼠肾组织LXRα表达;Western blotting和实时定量PCR检测第14天肾炎肾皮质LXRα蛋白和mRNA表达变化.结果 注射抗体后第14天尿蛋白达(167.03±42.50) mg/24h;新月体百分比达65％;肾炎大鼠肾小管上皮细胞核LXRα表达明显增加;肾炎组肾皮质LXRα蛋白表达明显高于同期对照组,但肾皮质mRNA表达则未见上调.结论 新月体型肾炎肾小管上皮细胞核LXRα蛋白表达增强,说明肾小管LXR通路参与此型肾炎的发病过程.
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实时定量PCR技术诊断PCP的研究进展
肺孢子菌肺炎(PCP)是一种由耶氏肺孢子菌引起的致死性肺炎,常见于免疫功能低下人群,早期诊断有助于临床治疗.目前常用的病原学检查漏诊率较高;定性PCR检测虽然敏感,但有时难以区分隐性感染和显性感染.实时定量PCR是近年来发展的一种精确、敏感、污染少的核酸定量技术.本文综述结果表明,实时定量PCR技术能快速、敏感、特异地检测肺孢子菌,可随时跟踪监测PCP的治疗效果,指导临床用药,有助于PCP的流行病学研究及其他基础生物学研究.
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实时定量PCR检测正常人外周血T细胞和胸腺细胞中sjTRECs水平
目的了解正常人外周血T细胞和胸腺细胞中信号结合T细胞受体删除 DNA环(sjTRECs)的含量,从而推测正常人中幼稚T细胞的含量和胸腺的输出功能. 方法利用实时定量PCR和TaqMan方法检测11例正常人外周血单个核细胞、7例儿童和3例成人胸腺细胞DNA中sjTRECs的水平. 结果正常人中sjTRECs含量分别为:8.83±4.81/1000个外周血单个核细胞;27.31±3.23/1000个成人胸腺细胞和170 .29 ±59.52/1000个儿童胸腺细胞. 结论 sjTRECs水平与年龄有关,正常人外周血中每1000个单个核细胞中约含4.5个幼稚T细胞.
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定量检测T细胞受体重排删除DNA环含量评价急性非淋巴细胞白血病患者胸腺近期输出功能
目的 检测急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者 T细胞受体重排删除DNA环(signal joint T-cell receptor excision DNA circles sjTRECs,TRECs)的含量,从而探讨患者的初始型naive T细胞水平和胸腺近期输出功能特点.方法利用实时定量PCR(TaqMan)方法,检测77例ANLL患者外周血单个核细胞(PBMC)TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平.14例ANLL缓解期患者和14例正常人外周血作为对照.结果 ANLL患者外周血中TRECs含量为(0.43±0.92)拷贝/1 000 PBMCs, (2.02±3.25)拷贝/1 000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平[(4.10±3.65)拷贝/1 000 PBMCs和(6.84±4.71)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0001]和缓解期患者[(2.19±2.49)拷贝/1 000 PBMCs和(6.30±7.13)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0005].各亚型ANLL患者的TREC水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 绝大多数ANLL型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,缓解期患者的胸腺近期输出功能有一定程度恢复.
关键词： T细胞受体重排删除DNA环 胸腺近期输出功能 白血病 实时定量PCR -
AML-M5患者外周血naive T细胞水平和TCR Vβ谱系利用特点
目的了解急性髓性白血病M5亚型(AML-M5)患者 T细胞受体重排删除DNA环(TRECs)的含量和TCR Vβ基因谱系利用和克隆性,从而了解AML患者的胸腺近期输出功能和TCR Vβ亚家族T细胞增殖特点.方法利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测5例M5患者外周血单个核细胞TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平.利用RT-PCR和基因扫描分析患者外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因表达和克隆性.9例正常人外周血作为对照.结果 M5患者外周血中TRECs含量为0.76±1.21/1000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平(6.84±4.71/1000 CD3+细胞,p<0.05).5例患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族(2-16个).基因扫描分析显示4例病人外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞, Vβ1,Vβ15和Vβ21克隆性T细胞均分别见于3例病人中.结论率先报道了AML-M5型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,尽管整体T细胞免疫功能低下,患者仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞,提示其具有一定地对白血病细胞相关抗原产生特异性免疫反应的能力.
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Nucleofection转染过程对Jurkat细胞BCL11b水平的影响
目的了解核转染(Nucleofection)过程对Jurkat细胞中BCL11b基因表达水平的影响情况.方法利用实时定量PCR方法检测分析经不同程序Nucleofection过程和不同时间培养的Jurkat细胞的BCL11b基因的表达水平.结果经Nucleofector的C-16、S-18和G-10+siRNA程序处理后,C-16与S-18组细胞培养2h的BCL11b水平明显升高(p<0.05),C-16、S-18和G-10+siRNA三组细胞培养10h后BCL11b水平均高于对照组(p<0.05).对照组、C-16和S-18组细胞随着培养时间延长(在2～24h之间),BCL11b水平降低(p<0.05),而在G-10+siRNA处理组,直到培养48h BCL11b水平才有所下降.结论 Nucleofection处理过程对Jurkat细胞BCL11b表达有一定的影响,但有一定的时效性.
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Ficoll分离和MACs分选对T细胞BCL11b表达水平的影响
目的了解Ficoll分离和MACs分选过程对T细胞中BCL11b基因表达水平的影响情况.方法利用Ficoll 分离3例正常人外周血单个核细胞(PBMC),进一步经MACs负性分选CD3+T细胞.分别收集培养0、6和20h的PBMC和CD3+T细胞,利用实时定量PCR方法检测各组样本中BCL11b基因的表达水平.结果经Ficoll分离的PBMC和MACs分选后CD3+T细胞在3个时间点BCL11b的表达水平无显著性差异(p>0.05),根据CD3+T细胞%标化后,各组BCL11b表达水平也均无显著性差异.结论 Ficoll分离和MACs负性分选过程不影响T细胞中BCL11b表达水平,提示其不会影响T细胞的活化.
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实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究
[目的]运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异.[方法]根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆人载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRTPCR检测基因的表达水平.[结果]北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P＜0.01)；耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P＜0.01).结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号.[结论]北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株.
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异常妊娠史孕妇弓形虫感染情况调查
采用实时荧光定量PCR调查了419例有异常妊娠史孕妇和178例无异常妊娠史孕妇(对照组)弓形虫感染情况,结果两组孕妇弓形虫感染率分别为22.20%(93/419)和4.49 %(8/178),差异有统计学意义(X2=23.44,P<0.05).419例孕妇中怀孕早期、中期和晚期孕妇弓形虫感染率分别为22.84%(53/232)、21.56%(22/102)和21.18% (18/85),各期感染率差异无统计学意义(P均>0.05).101例弓形虫感染者经药物治疗后转阴率为85.14% (86/101).
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B7-H1基因表达水平预测急性髓系白血病患者的诱导治疗反应
为了探讨急性髓系白血病(AML)患者白血病细胞B7-H1基因表达的临床意义,本研究应用SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR法检测了40例初治AML患者骨髓单个核细胞(BMMNC) B7-H1 mRNA的表达情况,跟踪检测了10例复发患者BMMNC B7-H1 mRNA的表达情况,并对40例AML患者的临床特征与B7-H1基因表达水平进行相关性分析.结果表明:初治AML患者BMMNC B7-H1 mRNA表达阳性,但表达水平低于正常人.复发时B7-H1mRNA表达水平较初诊时明显升高.B7-H1基因表达水平与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、骨髓中幼稚细胞比例、CD34抗原阳性与否均无相关性,但与治疗反应有显著相关性.诱导化疗后未获完全缓解(CR)的患者,其治疗前B7-H1 mRNA表达水平明显高于化疗后获得CR的患者.结论:初诊AML患者BMMNC B7-H1基因表达水平与患者在诱导化疗后是否获得缓解呈负相关.B7-H1基因表达水平有可能用于预测AML患者的预后.
