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颅内动脉瘤壁的定量蛋白质组学研究
目的 筛选动脉瘤壁差异表达蛋白质,为动脉瘤形成和破裂的分子机制研究提供思路.方法 收集破裂的14例动脉瘤壁标本,以匹配的14例颅脑外伤手术患者颞浅动脉做正常对照,等量混合同组内标本,采用同位素标记的绝对和相对定量技术(iTRAQ)和2D-LC-MS/MS法进行差异蛋白质分析.结果 共鉴定出蛋白质915个,其中差异2倍以上的蛋白质有255个,包括102个上调蛋白和153个下调蛋白.上调的蛋白质主要与细胞免疫炎性反应、细胞自噬与凋亡以及细胞黏附迁移等生物过程相关;下调的蛋白质主要与细胞骨架连接、细胞组分形态形成、信号传导和蛋白质转运有关.其中,细胞自噬诱导分子(TM9SF1)和杀青素1(AZU1)上调高为8.0倍;血管张力纤维形成相关蛋白质(SORBS2)下调显著为12.1倍.结论 破裂动脉瘤壁有多种蛋白质表达异常,其中TM9SF1、AZU1及SORBS2的变化可能参与了动脉瘤破裂的分子机制.
关键词： 颅内动脉瘤 蛋白质组学 同位素标记的绝对和相对定量技术 液质联用 -
衍生化LC-MS/MS测定大鼠血浆中新型抗流感药物帕拉米韦及其在药代动力学研究中的应用
目的:建立灵敏、可靠的衍生化LC-MS/MS新方法测定大鼠血浆中帕拉米韦的浓度.方法:血浆样品前处理包括蛋白沉淀和用盐酸(10 mol/L)-甲醇(10∶90, 体积比)为衍生化试剂的衍生化反应,测定采用LC-MS/MS.通过电喷雾电离源以选择反应监测(SRM)方式进行正离子检测,用于定量分析的离子反应分别为m /z 343→284(帕拉米韦衍生物)和m /z 299→152(内标Ro 64-0802衍生物).色谱分离采用Zorbax RX-C8 柱(2.1 mm × 150 mm, 5 μm),以乙腈-水-甲酸(30∶70∶0.1,体积比, 0.2 ml/min)为流动相.结果: 测定帕拉米韦的线性范围为10～10 000 ng/ml,相关系数r~2为0.9940,定量下限为10 ng/ml,批内和批间RSD%分别在5.0%和7.1%以内,准确度控制在89.9%～106.1%.结论:本方法通过衍生化反应,使帕拉米韦保留时间增加,基质抑制降低并使检测灵敏度提高.该方法成功应用于帕拉米韦非临床和临床研究中.
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酒石酸长春瑞滨长循环（热敏）脂质体在比格犬体内的药代动力学研究
目的：应用液相色谱质谱联用（ HPLC-MS／MS）建立长春瑞滨（ NVB）比格犬血浆检测方法并用于药代动力学研究。方法血浆样品采用蛋白沉淀和液－液萃取方法。色谱柱Venusil XBP C18（2．1 mm ×50 mm，3μm），柱温30℃，流动相∶水（10 mmol／L乙酸铵，1％乙腈）∶甲醇＝20∶80，流速0．3 ml／min，进样量5μl；采用正离子模式、电喷雾离子源（ESI）及多反应监测（MRM），NVB m／z 779．4～765．4，内标长春新碱m／z 825．4～122。结果 NVB在5～2500 ng／ml浓度范围线性良好（ r＝0．9994），准确度、精密度和提取回收率符合方法学验证要求，样品在－20℃和室温放置稳定性良好。比格犬给药后，Cmax分别为（833．51±150．42）和（1397．95±443．05） ng／ml、AUC（0－t）分别为（577．16±223．5）和（1059．82±408．27） ng／ml· h，Cl分别为（3014．64±1049．17）和（1633．10±551．77） ml／（h· kg）。显著性检验表明，两种制剂的Cmax、AUC（0－t）、AUC（0－∞）和Cl均有显著性差异（P≤0．05）。结论建立了准确、灵敏、可靠的定量检测比格犬血浆中NVB分析方法，可满足药代动力学研究。脂质体能提高药物达峰浓度，延长药物半衰期，增加药物暴露强度并降低毒性反应。
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宝乐果体外抗氧化作用
目的 研究宝乐果的体外抗氧化作用.方法 取新鲜宝乐果的提取浓缩液以及过大孔树脂柱后各流份,即总样、未吸附部位、水部位、30％醇洗部位和60％醇洗部位,共5个部位,用1,1-二苯基-2-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)清除法、2,2-联氨基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酰)二铵盐(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)清除法和还原力法分别测定各部位的抗氧化活性,以抗坏血酸(Vc)为阳性对照.对5个部位样品进行液质联用(LC-MS)分析,探讨抗氧化活性可能的物质基础.结果 样品对DPPH清除情况较好;对ABTS清除效果及还原力测定不明显;质谱总离子流图中保留时间在4.00 ～5.00 min处的某些成分可能参与抗氧化作用.结论 与Vc显著的抗氧化效果相比,宝乐果各部位抗氧化效果较温和,其抗氧化作用物质基础可能与总离子流图中响应显著的离子峰有关联.
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高效液相色谱串联质谱法测定食品中的10种真菌毒素
目的 建立同时检测食品中10种真菌毒素的前处理方法以及液质联用检测方法.方法 本文建立了加速溶剂提取法结合固相萃取净化的方法、凝胶渗透色谱法的方法分别对固体食品、液体食品中真菌毒素进行样品前处理,并且建立了可同时定量检测食品中10种真菌毒素(黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、新茄病镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的高效液相色谱-串联质谱多反应监测分析方法.结果 10种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好,线性相关系数均不低于0.999,检出限为0.006～1μg/L,高中低浓度的加样回收率为61.99％～103.97％,相对标准偏差为0.76％～10.63％.结论 该法快速、准确、灵敏度高,可用于固体及液体食品基质中真菌毒素的定量分析和质量监测.
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衍生化液质联用法测定大鼠血浆中丹皮酚的浓度
目的 建立灵敏、可靠的衍生化液质联用法测定大鼠血浆中丹皮酚的浓度.方法 血浆样品前处理包括蛋白沉淀和用对甲苯磺酰肼为衍生化试剂的衍生化反应,测定采用液质联用法.通过电喷雾电离源以选择离子监测方式进行正离子检测,用于定量分析的离子反应分别为m/z 335(丹皮酚衍生物)和m/z 479(内标孕二烯酮衍生物).色谱分离采用ZORBAX RX-C8柱(2.1 mm×150 mm,5μm),以乙腈-水-甲酸(55∶45∶0.1)为流动相,流速:0.2 ml/min.结果 测定丹皮酚的线性范围为2～2000 ng/ml,r 2为0.9993,定量下限为2 ng/ml,批内RSD为3.2％,准确度控制在89.7％～115.1％以内.结论 该法通过衍生化反应,使丹皮酚保留时间增加,基质抑制降低并使检测灵敏度提高,成功地应用于大鼠血浆中丹皮酚的药代动力学研究.
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降糖类中成药中非法添加新物质格列波脲的确证及裂解规律
目的 对降糖类中成药中发现的非法添加新物质格列波脲进行高分辨质谱确证,并对其质谱裂解机理进行初步研究,为其定性、定量与结构修饰提供参考依据.方法 用高分辨质谱仪测定阳性样品及对照品的分子离子,然后对其质荷比进行对比确认;利用ESI+离子阱液质联用仪测定三级质谱离子碎片,对结果进行裂解规律的分析.结果 计算高分辨质谱测定结果的误差,格列波脲对照品和样品[M+H]+均小于2 ppm,对照品和样品[M+Na]+均小于4 ppm.样品与对照品[M+H]+三级质谱均相同,一级质谱为m/z 367.17;二级质谱分子离子碎片有m/z 349.17、170.11、196.13;m/z 349.17三级质谱的离子碎片有m/z 152.08、135.13;m/z170.11三级质谱的离子碎片有m/z 152.07、109.02;m/z 196.13三级质谱的离子碎片有m/z 135.04、140.00、109.09、152.14.结论 样品中目标物为格列波脲,其易裂解部位主要为苯磺酰脲基团与手性分子桥之间的酰胺键,其次是手性分子桥中的一分子水及甲基.
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肾阳虚抑郁症模型大鼠的肝脏药物代谢酶活性变化研究
采用鸡尾酒法(cocktail)探究糖皮质激素诱导的肾阳虚抑郁症状态大鼠体内6种CYP450亚型酶活性变化.连续21天肌注氢化可的松,建立肾阳虚抑郁症大鼠模型;分别选用甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶碱、咪达唑仑、奥美拉唑和右美沙芬作为CYP2C6、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A2、CYP2D1、CYP2D2探针底物.采用液质联用法(LC-MS/MS)测定空白组和模型组大鼠体内6种混合探针的血药浓度,计算药动学参数.与空白组相比,模型组大鼠体内茶碱、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的代谢显著加快(P＜0.01),右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑的代谢无显著差异.结果表明氢化可的松诱导的肾阳虚抑郁模型CYP2E1、CYPlA2和CYP2C6均被诱导.
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慢性不可预见性温和应激模型大鼠的肝脏药物代谢酶活性变化研究
采用鸡尾酒(cocktail)探针药物法研究慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)造成的抑郁状态对大鼠体内6种CYP450亚酶活性的影响.根据Katz法建立CUMS大鼠抑郁模型;分别选用甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶碱、咪达唑仑、奥美拉唑及右美沙芬作为大鼠CYP2C6、CYP2E1、CYPl A2、CYP3A2、CYP2D1、CYP2D2的探针底物,采用液质联用法(LC-MS/MS)测定对照组与模型组大鼠体内6种混合探针的血药浓度,计算药动学参数.结果表明,茶碱和氯唑沙宗代谢显著加快(P＜0.01),甲苯磺丁脲、右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑的代谢无显著差异.结果说明,慢性不可预见性温和应激造成的抑郁状态对CYPl A2有强诱导、对CYP2E1有中强诱导作用.
关键词： 慢性不可预见性温和应激 液质联用 鸡尾酒法 细胞色素P450 -
大鼠重复注射米托蒽醌热敏脂质体产生ABC现象
考察大鼠重复注射米托蒽醌热敏脂质体是否产生加快血液清除现象(accelerated blood clearance phenomenon,ABC phenomenon).液质联用测定大鼠血浆中米托蒽醌浓度,并对血浆样品中抗聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) IgM抗体进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的检测.结果显示,第2次给药后药物清除速率变快,给药前血浆中抗PEG IgM抗体在第2次给药后被迅速中和.证明大鼠重复注射米托蒽醌热敏脂质体会产生ABC现象.
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LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定
运用液质联用、两种串联质谱对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定,确证其一级结构.将样品还原烷基化后,通过胰蛋白酶酶解蛋白,PNGase F去除多肽混合物中糖肽的糖基化,将去糖后的总肽用于液质联用系统,通过液相分离后,运用Q-TOF和线性离子阱两种串联质谱测定各个肽段的b,y碎片离子,分析测定融合蛋白FP3的氨基酸全序列.通过LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76％氨基酸序列测定,通过LC-ESI-Trap完成余下24％氨基酸序列测定.液质联用、串联质谱法测定蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确,是对重组蛋白结构分析和确证的重要手段.
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液质联用分析rhTNK-tPA的一级结构
液质联用分析重组人组织型纤溶酶原激活物变构体(TNK-tPA)的一级结构.用糖苷酶切除其糖基,测定质谱分子量;对其进行还原、烷基化、胰蛋白酶酶解,测定液质肽图及串联质谱图,通过质谱图的解析对氨基酸序列进行验证,并对翻译后修饰进行鉴定.该蛋白氨基酸序列与理论一致,其中约5％的M207发生氧化;约80％的T61发生岩藻糖化修饰;N103、N448、N184(约15％)存在N-糖基化修饰,糖型均为复杂型N-糖.液质联用结合适当的样品前处理方式,可快速、准确地对该蛋白的一级结构进行鉴定.
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HPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中优格列汀及其代谢产物
建立快速灵敏、简便的液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定Wistar大鼠血浆中优格列汀及其代谢产物M1[(R)-8-(3-羟基哌啶-1-基)-7-(2-丁炔-1-基)-1-((5-氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)-3-甲基-1H-嘌呤-2,6(3H,7H)-二酮],并研究优格列汀、M1在Wistar大鼠体内的药代动力学特征.优格列汀、M1分别以利格列汀和地塞米松为内标,血浆样品经乙腈沉淀蛋白后,以10％乙腈水溶液(含4 mmol·L-1醋酸铵,0.1％甲酸)-90％甲醇水溶液(含4 mmol·L-1醋酸铵,0.1％甲酸)为流动相,通过Grace Altima HP C18柱(2.1 mm×50 mm,5μm)梯度洗脱,色谱运行时间为4.4 min.采用电喷雾电离源,以多反应监测方式进行正离子检测.优格列汀、M1的标准曲线的线性范围均为0.5～500 ng·mL-1,定量下限均为0.5 ng·mL-1,日内和日间精密度(RSD)均小于14％.应用此法研究了Wistar大鼠口服灌胃给予优格列汀混悬液(27 mg·kg-1)后的药动学特点.本方法简便、准确、专属性强,适用于优格列汀和M1在Wistar大鼠体内的药代动力学研究.
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一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定
用两种方法即液质联用和紫外分光光度法对一种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比进行测定,为科学评价和有效控制药物抗体偶联比提供可靠方法.采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目；采用紫外分光光度计在252及280 nm处进行吸收度测量,根据抗体和药物在不同波长处的吸收系数不同,由二元一次方程求导出药物抗体偶联比.两种方法测得的药物抗体偶联比分别为3.21及3.25,结果相似,都可用于此种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比分析.
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中药单体小白菊内酯的大鼠血浆稳定性及其药动学研究
小白菊内酯是小白菊(Tanacetum parthenium)中的主要活性成分,具有抗炎和抗癌的药理活性.本研究首先建立了一种专属、灵敏、准确的大鼠血浆中小白菊内酯浓度定量的LC-MS/MS检测方法,采用一步液-液萃取法从大鼠血浆中提取待测物及内标,以水-甲醇为流动相系统对待测物进行分离.标准曲线范围为2～128ng·mL-1,精密度、准确度均符合要求,并且提取回收率较高.利用此检测方法对体外放置大鼠血浆样品中小白菊内酯的稳定性进行了考察,结果显示高、中、低3个浓度的小白菊内酯在30 min后均有超过15％的分解,表明其在大鼠血浆中稳定性较差.体内药动学实验分别静脉给予大鼠20、40及80 mg·kg-1的小白菊内酯,药动学参数显示其在大鼠体内消除较快,半衰期小于90 main.高剂量80 nmg·kg-1给药组初始浓度也仅为138.86±21.07ng·mL-1,并且药时曲线下面积与给药剂量非等比例增加.本研究结果为进一步开发小白菊内酯成为抗肿瘤药物提供了重要的药动学信息.
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液质联用进行干扰素理化对照品的一级结构鉴定及比对研究
应用UPLC与质谱联用技术对5个厂家生产的重组人干扰素理化对照品进行一级结构鉴定及比对研究.通过测定质谱分子量及胰蛋白酶酶解肽图,对其氨基酸序列进行验证,并对二硫键连接方式等翻译后修饰进行分析鉴定.结果5份对照品的实测分子量均与理论一致;液质肽图结果显示各样品的氨基酸序列均与理论一致;4批样品的二硫键连接方式为Cys1-Cys98、Cys29-Cys 138,1批为Cys29-Cys 139、Cys86-Cys99;部分样品存在N-末端“+Met”、乙酰化及蛋氨酸氧化等翻译后修饰.液质联用技术可用于干扰素理化对照品的一级结构鉴定及不同厂家产品的比对研究.
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左氧氟沙星中杂质的LC-MS/MS定量分析方法及其市售制剂的质量评价研究
建立了左氧氟沙星制剂中微量杂质的LC-MS/MS定量及筛查方法,方法学考察表明该方法快速、灵敏度高和专属性强.利用该方法对19个厂家市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行检测和质量评价.上述样品中超过杂质限度的杂质共检出5种,且不同厂家制剂中的杂质含量差异较大,仅3个厂家制剂中杂质的含量均低于0.01％.左氧氟沙星的N4'-甲基季铵类杂质在左氧氟沙星制剂中首次检出.结合杂质来源,认为左氧氟沙星药物制剂中杂质水平的差异与原料药、制剂工艺参数的控制及运输储藏的环境有着密切关系.该方法能专属、灵敏和全面地检测药物制剂中的杂质,为客观评价制剂质量及质量控制提供了高效的分析手段,所检出杂质种类及含量水平能客观地反映左氧氟沙星制剂的质量.
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基于超滤反应器的蛋白质N-糖基化快速分析方法
随着生物科技的发展,蛋白质药物正越来越多地被应用在疾病诊疗的各个方面.但是蛋白质的匀质性,特别是蛋白质N-糖基化修饰成为限制蛋白质药物发展的瓶颈,因此蛋白质N-糖基化修饰的分析方法正逐渐成为蛋白质药物研发的关键技术.为了提高蛋白质N-糖基化修饰分析效率,本文建立了基于超滤反应器的N-糖分离纯化方法.新处理方法大幅提高了含N-乙酰基葡萄糖N-糖的提取效率(10％～20％),避免了唾液酸结构的降解(20％～100％),同时将处理时间缩短至30 min.通过与HPLC-HRMS分析方法联用,提高了样品分析效率.本文建立了高效、可靠,适合蛋白质药物的N-糖基化修饰分析方法.
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基于UHPLC-Q Extractive轨道阱高分辨质谱的款冬花、叶的化学比较
款冬花是中医临床常用药材,具有止咳化痰作用.款冬叶也具有相似的药理作用.对款冬叶和花进行系统的化学比较,有助于进一步促进款冬叶的资源利用.本研究采用高分辨液质联用技术对款冬花和叶进行了化学比较,采用靶标和非靶标结合的指认策略鉴定化学成分43种,进一步分析显示款冬酮、款冬花素酯等倍半萜类物质在花中的含量远远高于叶,而绿原酸、异绿原酸等苯丙素类物质在叶中的含量高于花蕾;黄酮类物质金丝桃苷、槲皮素在款冬花和叶中含量接近,而芦丁、山柰酚在款冬花中含量较高.说明款冬花和叶含有相似的化学成分,但款冬叶中以绿原酸类为代表的苯丙素类成分含量较高,而这类成分与止咳化痰作用密切相关.本研究为款冬叶的资源利用奠定了基础.
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两种晶型尼莫地平片剂在恒河猴体内药代动力学研究
尼莫地平(nimodipine)是选择性作用于脑血管平滑肌的钙拮抗剂,存在着多晶型现象.本文用粉末X射线衍射表征了两种片剂晶型,通过体外溶出实验比较了两种片剂的溶出度,利用LC-MS建立恒河猴血浆中尼莫地平测定方法,并研究了尼莫地平两种晶型原料药制成的片剂在恒河猴体内的药代动力学特性.结果显示,两种片剂晶型上存在差异,参比片剂比晶型片剂溶出度高1.3％,恒河猴口服两种晶型片剂各2.5 mg·kg-1后,晶型片剂血药峰浓度相比参比片剂高了37.3％,曲线下面积增加29.8％,拟合计算后的大血药浓度(Cmax)分别为(381.4±327.3)和(178.0±214.8) μg·L-1.药时曲线下面积(AUC0-t)分别为(853.1±500.7)和(646.5±430.3) μg·L-1·h.这提示不同晶型尼莫地平片在恒河猴体内血药浓度变化有一定差异,控制尼莫地平晶型对于保证药物的临床治疗效果具有重要意义,也说明了仿制药一致性评价工作开展的必要性与迫切性.
