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人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达
目的:构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性.方法:应用DNA重组方法将编码hIGF-1 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/hIGF-1真核表达质粒;应用阳性脂质体介导的基因转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1瞬时转染C2C12成肌细胞中;采用RT-PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF-1基因在成肌细胞中的表达情况;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF-1的生物活性.结果:将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1转染成肌细胞后,hIGF-1 mRNA及蛋白表达水平明显增高;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性.结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hIGF-1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF-1蛋白的表达,所表达出hIGF-1蛋白具有生物学活性.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 真核表达载体 成肌细胞 -
hIGF-1转基因对周围神经损伤后脊髓运动神经元作用的实验研究
目的 观察周围神经损伤局部转染外源性人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因对脊髓运动神经元的保护作用.方法 90只雄性Wistar大鼠,建立坐骨神经挤压伤模型后随机分为3组.hIGF-1治疗组:挤压伤处神经外膜下即刻注射pcDNAhIGF-1和LipfectAmine转染液10 μl;模型组注射pcDNA3.1、LipfectAmine和蒸馏水混合液10 μl ;空白对照组:不注射任何物质.术后免疫组化法观察不同时相hIGF-1在脊髓的表达,TUNEL法检测运动神经元的凋亡,Marsland和LFB双重染色观察运动神经元细胞以及胞体内尼氏体的病理变化,通过脊髓前角超微结构观察神经毡的变化.结果 hIGF-1在周围神经损伤局部转染可以通过轴浆运输在脊髓前角表达,其表达高峰在转染后1 w左右.转染后7、14和21 d,hIGF-1治疗组脊髓运动神经元的凋亡数少于模型组及空白对照组(P＜0.01).转染后2、7、14和28 d脊髓前角运动神经元细胞数hIGF-1治疗组多于模型组及空白对照组(P＜0.01),且hIGF-1治疗组胞质内尼氏体的消退变化较另两组轻.转染后56 d脊髓前角超微结构hIGF-1治疗组神经毡大致正常,模型组及空白对照组见突起间隙增大,局部空化.结论 周围神经损伤后应用外源性胰岛素样生长因子-1有保护脊髓运动神经元的作用.
关键词： 周围神经 人胰岛素样生长因子-1 脊髓 神经毡 -
天麻素片联合盐酸帕罗西汀对老年脑卒中后焦虑抑郁患者血清BDNF、IGF-1浓度的影响
目的 探讨天麻素片联合盐酸帕罗西汀对老年脑卒中(中风)后焦虑抑郁患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)、人胰岛素样生长因子(IGF)-1浓度的影响.方法 100例老年中风后焦虑抑郁患者,将50例接受单独的盐酸帕罗西汀治疗患者纳入对照组,50例接受天麻素片联合盐酸帕罗西汀治疗患者纳入研究组,均治疗2个月.比较两组治疗前后焦虑抑郁〔汉密尔顿焦虑量表(HAMA)、汉密顿抑郁量表(HAMD)〕评分、血清BDNF、IGF-1浓度、不良反应发生率.结果 治疗后两组HAMA、HAMD评分均低于治疗前,且对照组高于研究组(均P<0.05);治疗后两组血清BDNF浓度均高于治疗前,且研究组高于对照组,IGF-1浓度均低于治疗前且研究组低于对照组(P<0.05);两组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 采用天麻素片联合盐酸帕罗西汀治疗效果显著,安全性高,能有效提高血清BDNF表达水平,减少血清IGF-1表达,减轻焦虑、抑郁症状,改善患者生活质量.
关键词： 天麻素片 盐酸帕罗西汀 焦虑抑郁 脑源性神经营养因子 人胰岛素样生长因子-1 -
胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性
目的 构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性.方法 以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆人pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆人表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析.MTT法检测rhlGF-1促MCF-7细胞的增殖作用.结果 转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7 700的目的 蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%.Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用.结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 原核表达 纯化 生物学活性 -
骨碎补结合组织工程软骨促进软骨再生的实验研究
目的:评估骨碎补结合组织工程软骨治疗对实验兔软骨缺陷模型软骨再生的疗效.方法:将hIGF-1基因转染MSCs,并与脱细胞真皮基质(ADM)构建组织工程软骨.24只新西兰白兔随机分为A、B、C、D四组,A、C组进行自体软骨移植,B、D组进行改建的细胞-ADM移植.C、D组用40％骨碎补汤喂养4周,150 mL/d.第12周处死实验动物,分离缺损关节软骨部位,蜡块包埋染色,通过总体形态评价软骨再生组织.采用组织学评分评估再生软骨质量.采用甲苯胺蓝染色评价缺损部位产生软骨糖胺聚糖的情况.结果:与B组比较,C组和D组的新生软骨覆盖度、新骨髓的颜色、缺损边缘和表面粗糙度均显著提高(P＜0.05);再生软骨的组织学评分软骨表面评分显著改善(P＜0.05).C组与D组具有比其他组更好的基质、细胞分布和表面指数.并且有较厚的透明样软骨组织,具有正常的糖胺聚糖产生.表明该治疗方法可以通过再生透明样软骨且没有不良事件来减少软骨缺陷.结论:工程软骨结合骨碎补治疗可显著改善兔膝关节软骨缺损修复的质量,为临床治疗软骨病变提供重要理论依据.
关键词： 骨碎补 人胰岛素样生长因子-1 关节软骨缺损 -
人胰岛素样生长因子-1与肠外营养
人胰岛素样生长因子-1是一种对机体生长和代谢具有广泛作用的分泌蛋白,与机体的营养调节密切相关.本文综述其对机体代谢的作用、作用机制,讨论其在肠外营养条件下的辅助治疗作用.
关键词： 肠外营 人胰岛素样生长因子-1 -
钴金属螯合亲和层析在hIGF-1融合蛋白分离纯化中的应用
为探讨钴金属螯合亲和层析应用于分离纯化制备人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)的可行性与纯化条件,以重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,使用钴亲和层析技术分离纯化其表达产物并与镍亲和层析比较,在此基础上尝试应用钴亲和层析分离纯化制备较大量的hIGF-1融合蛋白.结果显示,钴亲和层析在分离纯化hIGF-1融合蛋白时表现出更好的可操作性与纯化效果,线性放大条件后分离纯化效果稳定,制备hIGF-1融合蛋白产物纯度约为95％,蛋白获得率约为10.78％.研究初步建立了切实可行的钴金属螯合亲和层析分离纯化制备hIGF-1融合蛋白的工艺.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 金属螯和亲和层析 固相化金属离子亲和层析 六聚组氨酸 纯化 镍离子 钴离子 -
利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究
目的利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1).方法将15 kD人IGF-1(hIGF-1)前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中,经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后,通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV/IGF-1.以BmNPV/IGF-1感染5龄家蚕幼虫,分别在感染后24、48、72、96、108、120 h提取家蚕血淋巴液,以ELISA法测定不同时象家蚕血中IGF-1浓度,采用Western-blot分析鉴定IGF-1免疫学活性,MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响.结果 ELISA测定显示,BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫后,72 h起蚕血中IGF-1浓度随感染时间延长而逐渐增高(19.09～23.36 μg/ml),120 h IGF-1含量达到高值(23.36 μg/ml),Western-blot分析发现表达产物在蚕体内被加工成7.5 kD成熟hIGF-1,并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应,其促细胞增殖能力明显优于来源于E.coli的IGF-1标准品.结论具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF-1能够在家蚕幼虫虫体中获得高效表达.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 基因表达 重组家蚕核型多角体病毒 生物学活性 -
人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化
目的:构建含有人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)前体编码全长cDNA的重组载体,使其在E.coli BL21(DE3)中表达,并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化,同时探讨其抗原性及应用价值.方法:采用PCR法,扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a(+)/hIGF-1重组载体,然后将其转化入BL21(DE3)中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性.结果:重组质粒pET32a(+)/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.BL21(DE3)表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示,其表达量占细菌总蛋白量的25%左右,该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90%以上.Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带,表明此重组蛋白具有免疫学特异性.结论:pET32a(+)/hIGF-1重组载体构建成功,并能够高效表达.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 前体PCR 重组蛋白 亲和层析 -
抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 单克隆抗体 重组蛋白 -
人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达
目的 构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统.方法 用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的 基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的 基因在靶细胞的表达.结果 经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染入骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白.结论 成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 逆转录病毒 骨髓基质干细胞 -
利用杆状病毒载体高效表达人胰岛素样生长因子-1及其纯化的研究
目的:利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1).方法:将15kDhIGF-1前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中,构建重组病毒BmNPV/IGF-l.用BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫,提取家蚕血淋巴液,采用亲和层析法纯化rhlGF-1,ELISA法测定rhIGF-1含量,用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性,MTF法观察其对MCF-7细胞增殖的影响.结果:ELISA测定显示,BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫120h rhIGF-1含量达高值(23.36μg/ml).rhIGF-1纯度为40%,Westem-blot分析发现主要纯化产物为7.5 kD成熟hIGF-1.细胞活性刺激实验显示,纯化后rhIGF-11对MCF-7细胞促增殖能力明显优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品.结论:实现了具有免疫学活性及生物学活性rhlGF-1在杆状病毒表达系统的高效表达,并使rhIGF-1得到初步纯化.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 基因表达 重组家蚕核型多角体病毒 亲和层析 生物学活性 -
人胰岛素样生长因子-1在急性损伤肩袖腱-骨愈合过程中的组织学研究
目的 应用大鼠建立急性肩袖损伤模型,观察人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1)在腱-骨愈合过程中的作用.方法 取16只成年雄性SD大鼠,均行右侧冈上肌切断术,建立急性肩袖损伤模型.随机分为2组:空白组(生理盐水)、实验组(rhIGF-1/IGFBP-34.0mg/kg/day),术后第1天开始,连续14天于腹部皮下注射.术后1周和4周,各组取4只大鼠以冈上肌腱的重建止点为中心取材.经苏木精-伊红染色和免疫组化定位增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen、PCNA)和Ⅷ因子(FactorⅧ)定性评估细胞增殖和新生血管形成;应用苦味酸天狼猩红染色,采用偏光显微镜半定量分析在腱-骨插入位点的胶原纤维组织的连续性和排列规律性.结果 术后1周时,苏木精-伊红染色光学显微镜下观察,实验组较对照组在腱-骨插入位点和肌腱腱实质部均显示较多细胞增殖和血管生成.实验组较对照组增殖细胞核抗原免疫组化提示有更积极的细胞分裂,内皮细胞Ⅷ因子免疫组化提示局部有更丰富内皮细胞;术后4周苏木精-伊红染色,实验组局部出现了不成熟的类软骨细胞.苦味酸天狼猩红染色,实验组较对照组更可见排列规则的兰染的软骨基质,且和骨质连接紧密,其间可见少量纤维软骨细胞,骨质和纤维软骨带界限更清晰.结论 人胰岛素样生长因子-1能促使细胞增殖,形成类似于肩袖天然纤维软骨插入点,为临床促进腱骨愈合提供了一种思路.
关键词： 腱-骨愈合 肩袖 人胰岛素样生长因子-1 修复外科手术 -
重组人胰岛素样生长因子-1大肠杆菌高密度发酵研究
目的 建立重组人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)在大肠杆菌高密度发酵中表达的工艺.方法 以工程菌DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,通过分批发酵培养优化溶解氧浓度、pH及温度等发酵条件,在此基础上以甘油为限制性基质进行分批补料发酵,考察不同补料方式对发酵的影响.结果 适合重组hIGF-1在工程菌高密度发酵中表达的条件:在菌株活化与初始培养后,诱导时控制发酵系统溶解氧浓度为20%,温度为30 ℃,pH为7.2并以恒定pH反馈补料,发酵12 h菌体密度OD600达44.53,得菌体干质量17.49 g/L,平均生产强度为1.458 g·L-1·h-1,其中重组hIGF-1的相对表达量为32.5%.结论 研究为工业化生产hIGF-1奠定了基础.
关键词： 高密度发酵 重组大肠杆菌 人胰岛素样生长因子-1 -
人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达
目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达.方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs.分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1 mRNA和蛋白的表达.结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462 bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经Hind Ⅲ与BamHⅠ双酶切后,得到5 428 bp和462 bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达.结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 基因转染 人脐带血 神经干细胞 -
人胰岛素样生长因子-1基因表达载体的构建
目的 构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因的表达载体.方法 通过聚合酶链反应(PCR)方法从PCDB-hIGF-1质粒中扩增出392 bp的靶片段,将其黏端克隆至pET-His表达质粒,然后应用限制性酶切、PCR扩增及序列测定等技术进行鉴定.结果 成功构建了hIGF-1表达片段,酶切及测序证实读码框正确.结论 成功克隆HGF-1表达载体,为体外表达蛋白和行免疫治疗勃起功能障碍奠定基础.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 克隆 -
Sonic hedgehog参与人胰岛素样生长因子-1信号通路促使下颌骨髁突过度生长的实验研究
目的:通过活体动物实验观察人胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)与Sonic hedgehogxinh(Shh)介导的信号通路促进了髁突过度生长的作用.方法:制备IGF-1高表达表型转基因小鼠模型.将转基因鼠随机分为为5组:Cyclopamine刺激组;NVP-AEW541刺激组;IGF-1刺激组;Cyclopamine+IGF-1刺激组;生理盐水刺激组:空白对照,每组3只.随机选取一侧关节腔自31 d起隔天连续进行上述药物注射,共14 d,注射结束后收获实验侧髁突,固定,比较两侧髁突大小,分析差异性.结果:Cyclopamine刺激组及生理盐水刺激组实验侧与对照侧髁突大小比较差异无统计学意义.NVP-AEW541刺激组、IGF-1刺激组以及Cy-clopamine+IGF-1刺激组实验侧髁突小于对照侧髁突(P<0.05).结论:IGF-1介导的信号通路促进了髁突肥大髁突的过度生长.
关键词： 髁突肥大 音猬因子 人胰岛素样生长因子-1 -
hIGF-1基因修饰骨髓基质干细胞复合PLGA移植修复关节软骨缺损
目的:研究人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因修饰的骨髓基质干细胞(MSCs)复合PLGA材料移植对关节软骨缺损的修复作用.方法:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出hIGF-1基因,亚克隆后酶切出目的片段插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,鉴定后转染兔MSCs并检测hIGF-1在其中的表达;将转染细胞复合PLGA支架材料立体培养后植入实验性兔关节软骨缺损处,不同时间取材,检测对软骨缺损修复的效果.结果:成功构建了GFP标记的真核载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并在靶细胞中得到理想表达;hIGF1基因修饰的MSCs复合支架材料移植明显促进了缺损软骨的修复质量,组织学评分与对照组相比有统计学差异(P＜0.05).结论:IGF-1是软骨组织工程种子细胞MSCs基因修饰的理想候选基因,以之修饰的MSCs作为种子细胞可以明显提高组织工程方法对软骨缺损的修复效果.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 骨髓基质干细胞 关节软骨缺损 -
含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达
目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.
关键词： 人胰岛素样生长因子-1 腺病毒载体 骨髓间充质干细胞
