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"人参四逆汤"药效物质及其作用机制和软电离质谱对复方物质基础研究
主要完成如下几方面的工作.1.从人参四逆汤中分离鉴定了有明显正性肌力作用的有效成分丙三醇-二-呋喃半乳糖甙和尿嘧啶;有明显负性肌力作用的有效成分:人参皂甙-Rb1、-Rb2、-Rc、-Rd、-Re、-Rg1、-Rg2.同时从干姜中分离鉴定了与附子乙醚精提物对原代培养内皮细胞释放PGl2有协同作用有效成分3,5-二羟基-1-(3-甲氧基4-羟基苯基)癸烷(Gl-a)、5-羟基-1-(3-甲氧基4-羟基苯基)癸酮-3(Gl-d)、5-羟基-1-(3-甲氧基苯基、癸酮-3(Gl-e)、1-(3-甲氧基4-羟基苯基)-癸酮-3(Gl-h);也从附子中分离鉴定了与干姜乙醚精提物有协同作用的乌头碱(Fl-a、中乌头碱(Fl-d)、苯甲酰中乌头碱(Fl-e)和总脂肪酸酯生物碱(Fl-h).
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血管内皮细胞凋亡与功能的生物力药理学调节
为探讨川芎嗪和剪应力对血管内皮细胞凋亡的影响,以锥一板旋转式剪切装置提供剪应力,与川芎嗪共同作用于大鼠微血管内皮细胞(rCMECs),采用Annexin V-FITC染色标记,利用全内反射衰逝波激发ICCD成像技术,探测川芎嗪和剪应力对rCMEC磷脂酰丝氨酸(PS)异位的影响.结果表明,培养内皮细胞膜表面PS异位具有普遍性,静态培养内皮细胞的PS异位率(异位程度)为9.97%.作为单因素,剪应力(6、12、24dyn/cm2)或川芎嗪(31.5,63.0,126.0μg/ml)均可使PS异位率明显下降(P＜0.001).在同一剪应力水平条件下,川芎嗪的给予可使内皮细胞的PS异位率进一步降低.中等水平的两因素组合降低异位率的效果较突出.结果提示,适当水平的剪应力与川芎嗪联合作用有可能明显抑制内皮细胞凋亡.
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培养人脐静脉内皮细胞慢性缺血缺氧模型
目的建立改良的体外培养人脐静脉内皮细胞缺血缺氧的模型.方法取培养人脐静脉内皮细胞,用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,使培养细胞处于缺血缺氧状态.检测缺血缺氧细胞的形态、培养液中乳酸脱氢酶漏出量及Ⅷ因子相关抗原表达及细胞死亡率.结果与对照组相比,随着缺血缺氧时间的增加,内皮细胞形态发生明显改变 ,细胞浆内出现空泡样变性,细胞死亡率增加,Ⅷ因子相关抗原表达及细胞乳酸脱氢酶漏出量均显著增加(P < 0.01).结论该模型可使细胞受到渐进性损伤,损伤结果与体内细胞缺血缺氧后所致的病理学变化相似,证实该模型具有一定的可靠性、操作简便、可重复性强.
关键词： 乳酸脱氢酶: 细胞低氧 培养内皮细胞 缺血缺氧细胞 模型 -
剪切力对培养内皮细胞原癌基因表达的影响
内皮细胞位于血管壁的内层，因其独特的解剖位置，内皮细胞常常暴露于血液流动所产生的血流应力的作用下。血液在流动过程中，对不同血管的内皮细胞有着不同类型、不同强度的力学作用。血管的锥度、分枝分叉等均可改变血流方式，使内皮细胞所受的切应力大不相同。在生理稳态范围内，组织(或器官)内的应力分布应使得组织(或器官)处于某种优化状态[1]。血液流动对血管壁产生的力包括由于对血管壁面摩擦而产生的剪切力、血管周向应力和压应力。离体血流系统模型证明剪切力可调节内皮细胞结构和功能的各个方面，这些影响在一定程度上是由于对内皮细胞转录水平的调节。这里所述的主要是对原癌基因的调节。原癌基因是在细胞受刺激后，短时间内由转录因子或称第三信使迅速调控表达。细胞通过选择性诱导这些基因而对外部刺激作出应答。原癌基因在未受刺激的细胞中表达量极其微弱，但受刺激后几分钟即可检测到这些基因转录的mRNA。但这些基因诱导是短暂的，其mRNA寿命很短，而且诱导这些基因并不依赖于新蛋白的合成。这些变化主要是由于内皮细胞对剪切力开始作用后的反应是产生一定的第二信使激活特定的代谢通路，这些在细胞功能方面的迅速改变常常伴有蛋白的合成，这在剪切力作用后几小时内即可检测出来。原癌基因有多种，如c_fos、c_jun、c_myc、egr_l、c_kit、c_myb、c_met、c_ets_1、bcl_2、c_mas、fps、fes、ret、c_fms、c_src等等。血流状况不同，即剪切力作用方式、大小、持续时间的不同，对基因表达的调节也不同。下面分别阐述。1c_fosc_fos是编码AP－1家庭的一个DNA结合蛋白。在静止状态下(不受剪切力的情况)，培养内皮细胞内的c_fos的转录水平很低，但在剪切力作用下，可直接导致c_fos转录及翻译水平表达量增高[2]。尤其高水平剪切力(如25达因/平方厘米)，c_fos可很快达到高水平(高可达基础水平的20倍)，然后很快回到基线水平[3，4]。剪切力大小不同，对c_fos基因的调节作用也不同，vibhuRanjanandScottL.Diamond的研究指出在培养的人脐静脉内皮细胞中，核内c_fos蛋白水平在动脉水平剪切力(25达因/平方厘米)作用时比在静止状态(无剪切力作用)时高5.4＋/－2.0倍(P<0.01);而在低水平剪切力(4达因/平方厘米)作用下，内皮细胞中c_fos水平仅轻度增加，但比静止状态高2.4＋/－0.73倍(P<0.01)[5]。这是由于剪切力作用于内皮细胞后，诱导c_fos基因转录和其蛋白质转运过程均有蛋白激酶E，G－蛋白，磷脂酶C和细胞内钙离子参与[6，7]。上述无论是高水平剪切力还是低水平剪切力都指的是稳定的层流。就层流而言，稳定性的和波动性的对内皮细胞的c_fos的影响也是不同的。Hdyue_JenHsieh等研究表明波动性血流(频率为1赫兹，平均剪切力为16达因/平方厘米)使培养的人脐静脉内皮细胞内的c_fos在受到血流剪切力作用0.5h后迅速而明显地增加，1h后降到基础水平。稳定的血流(剪切力为16达因/平方厘米)使培养的人脐静脉内皮细胞内的c_fos水平的增加程度较波动性血流轻而且短暂[8]。在人体中，除了大多为层流外，有一些部位如动脉分叉部、弯曲部等这些动脉粥样硬化好发部位是涡流频发部位，它形成空间剪切力梯度，涡流对内皮细胞基因的影响与层流是不同的[9]。TobiNagel指出涡流时的剪切力使培养的人脐静脉内皮细胞内的c_fos增加的程度比层流大，用平均灰度值来表示分别为1018和397[10]。
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三维培养内皮细胞形成血管样结构的实验研究
促进缺血组织新生血管的形成是当今治疗这类疾病的新思路,其关键是选择一合适的促血管 形成生长因子.传统的二维细胞培养方法可以观察生长因子对于培养内皮细胞增生、移行 的影响,但因其不能提供细胞生长的三维空间,难以研究生长因子在促进培养内皮细胞形 成血管样结构中的作用,因此对于评价生长因子的促血管再生作用有一定局限性.
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剪切力促进内皮细胞种植黏附力的研究进展
血管和瓣膜内皮细胞种植面临的重要问题之一是提高内皮细胞和细胞外基质(ECM)的黏附力.剪切力环境下培养内皮细胞是改善心脏瓣膜和血管的内皮细胞种植效果的主要方法之一.本文旨在对近几年剪切力促进内皮细胞黏附的整合素信号传导途径和临床基础研究两方面进行综述,探讨体外培养内皮细胞时合适的剪切力指标.
