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脂肪干细胞分离纯化方法研究进展
脂肪干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程中，而获得足够量的、活性高的、高纯度的脂肪干细胞是其在组织工程中应用的前提。本文综述近几年来脂肪干细胞分离纯化方法的研究进展，比较各方法的优缺点，为分离纯化出理想的脂肪干细胞提供理论依据。
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佐剂性关节炎模型兔成纤维样滑膜细胞的培养
背景:目前研究者多采用酶消化法从类风湿性患者和佐剂性关节炎大鼠的滑膜组织中分离培养成纤维样滑膜细胞,采用组织块贴壁法体外培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞较少见.目的:建立佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞的培养方法并观察细胞的生物学特性.方法:采用多点多次注射佐剂的方法制备佐剂性关节炎兔动物模型,取膝关节滑膜组织,用组织块贴壁法分离培养成纤维样滑膜细胞,观察细胞形态特征.采用CCK-8法检测细胞增殖情况,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达.结果与结论:倒置显微镜观察原代培养的关节炎兔滑膜细胞形态均为长梭状纤维样,符合成纤维样滑膜细胞的生长特征,且表达波形蛋白的细胞达98%.说明采用组织块贴壁法成功分离培养了佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞.
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冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化
背景：在骨组织工程中，脐带间充质干细胞是的一种新兴的种子细胞。目前认为低温冻存是长期保存细胞的有效方法。
目的：探究冻存的脐带间充质干细胞能否被诱导分化成成骨细胞。
方法：采用组织块贴壁法从脐带的华尔通氏胶组织中分离出间充质干细胞。然后，用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态。脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期用流式细胞仪检测。在冻存6个月后，复苏第2代脐带间充质干细胞进行冻存复苏，并传代培养至12代。对第12代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导，它的成骨能力分别通过碱性磷酸酶活性检测，骨钙素和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定。
结果与结论：原代脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维细胞样形态。流式细胞仪显示培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志CD73、CD105和CD90，但是不表达造血细胞的表面标志CD34和CD45。复苏后细胞的存活率是90%。细胞周期显示P8的细胞有75%处于G0/G1期，25%处于S+G2M期。经成骨诱导液处理的第12代细胞显示出比对照组更高的碱性磷酸酶活性(P <0.01)。此外，在成骨诱导液中诱导的细胞对骨钙素和骨涎蛋白的染色呈阳性，并形成矿化了结节。冻存后的脐带间充质干细胞仍保持了它们的生物学特性，并且在成骨诱导液中能被诱导分化成成骨细胞。 -
Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞
背景：椎间盘为负重却缺乏血运的组织，在体外培养过程中存在表型丢失问题，因而容易发生退行性改变，但椎间盘退变的机制尚不明确。
目的：探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法，并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。
方法：应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法，分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增，用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况，计数细胞数量，并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况，并进行细胞鉴定。
结果与结论：成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现，髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强，活力旺盛，但随着传代次数的增加，细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合，可获得高纯度的髓核细胞，培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长，第1-3代细胞生长活性较强。 -
改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞
目的 采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs).方法 无菌条件下取足月婴儿脐带,采用改良组织块贴壁法分离间充质干细胞,台盼蓝染色法计数单个核细胞数,倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型.结果 原代hUCMSCs的数量为(1～ 5)× 105个.培养至8d,组织块边缘处有单细胞爬出;培养至2周,贴壁生长的细胞散在分布或形成小克隆;培养至20 d,细胞呈梭型、三角形或多角形.培养第20天的原代hUCMSCs的G0/G1期细胞占88.12％,S期细胞占1.23％,G2/M期细胞占10.65％,大多数细胞处于细胞增殖的潜伏期,CD105阳性率为97.65％,CD34阳性率为2.54％.结论 采用改良组织块贴壁法分离了hUCMSCs,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,为其临床应用奠定了基础.
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移植物动脉硬化模型大鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定
目的：探讨大鼠腹主动脉移植后，血管平滑肌细胞（VSMC）的分离、培养方法。方法建立BN至Lewis腹主动脉移植的慢性排斥反应、动脉硬化模型，60d后用组织块贴壁方法分离、培养血管平滑肌细胞并进行传代。采用形态学和肌动蛋白免疫组化鉴定证实为VSMC。结果细胞呈典型的“峰-谷”样生长，历次传代鉴定均为高纯度VSMC，传代至6代左右仍能保持原有性状，细胞活力未见减低。结论组织块贴壁法培养大鼠腹主动脉移植后VSMC具有操作简单、细胞活力高、纯度高等优点，可作为研究器官移植慢性排斥反应、移植物动脉硬化新的体外实验模型。
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胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠RASMCs生长、增殖及分化对比观察
目的 比较胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMCs)生长、增殖及分化的影响.方法 选择6~8周龄雄性SD大鼠6只,取胸主动脉及主动脉弓部,保留中膜备用.分别采用胶原酶消化法、组织块贴壁法培养RASMCs.采用α-肌动蛋白免疫荧光染色法鉴定RASMCs,并比较两种方法培养第0、24、36、48、60、72、84、96 h RASMCs生长情况.采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期.采用实时定量PCR法检测细胞表型标志基因表达,包括收缩型标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转胶蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重链11(MYH-11)、转录因子1(SP-1)及合成型标志基因骨桥蛋白(OPN).结果 胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离出RASMCs,细胞纯度均在95%以上.培养36、48、60、72 h时,组织块贴壁法分离、培养的RASMCs计数多于胶原酶消化法(P均<0.05).培养36、48、60、72 h时,胶原酶消化法分离、培养的RASMCs活力优于组织块贴壁法(P均<0.05).两种方法分离、培养的RASMCs G1、G2、S期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05).胶原酶消化法分离、培养的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相对表达量均高于组织块贴壁法,OPN mRNA相对表达量低于组织块贴壁法(P均<0.05).结论 胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离、培养出RASMCs.胶原酶消化法分离、培养的RASMCs生长、增殖较慢,但保持收缩表型;组织块贴壁法分离、培养的RASMCs生长、增殖较快,但有向合成表型转化的趋势.
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人脐带间充质干细胞分泌肝细胞生长因子的初步研究
目的 研究体外传代培养的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分泌肝细胞生长因子(HGF)的量及其变化.方法 无菌条件下收集健康胎儿脐带15(人)份,并收集脐带供者资料,脐带采用组织块贴壁法分离培养UC-MSCs,并做传代培养;P3代UC-MSCs流式细胞仪检测免疫表型,成骨成脂诱导分化鉴定;采用ELISA法检测细胞培养上清中HGF的含量.结果 15份健康胎儿脐带均培养出UC-MSCs.P3代UC-MSCs的细胞表型均为CD90 +/CD105+/CD166 +/CD14-/CD34-/CD45-/CD79a-/HLA-DR-.3份P3代细胞分别经过成骨和成脂诱导分化培养,诱导分化成骨细胞和脂肪细胞.体外传代培养的UC-MSCs均分泌细胞因子HGF;各传代细胞(n=15)P1、P3、P5和P7细胞上清中HGF含量(pg/mL)分别为32 754±15 147、26 029±11 680、11 660±5 137和3 105±2 197.15份脐带供者信息包括:孕产妇年龄(24 ～41岁)、孕周(37 ～40周)、胎儿体重(2.8～4.1kg)、胎儿性别(男性7例、女性8例).上述供者因素与P3和P5代UC-MSCs分泌的HGF量无相关性(P＞0.05).结论 UC-MSCs分泌HGF的量随着传代次数的增加而降低,且上述供者因素对UC-MSCs分泌HGF的量没有影响.
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小鼠主动脉平滑肌细胞原代培养常见问题及处理对策
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在人类心血管疾病发生发展中具有重要作用,以VSMC为实验研究对象,研究心血管疾病相关发病机制是目前研究的热点.而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠主动脉平滑肌材料有限,因此探讨小鼠主动脉VSMC原代培养技术方法,对于提高VSMC原代培养成功率具有重要意义.本文就小鼠主动脉平不骨肌细胞原代培养问题及处理对策做一综述.
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大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定
目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（ VSMC）培养方法。方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。
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改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞
目的 建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs).方法 将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75％酒精的烧杯中浸泡消毒.在无菌条件下剖开胸腹腔,取出大鼠的心肺组织,然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段,去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后,用组织块贴壁法培养PASMCs,并传代、冻存和复苏,倒置相差显微镜观察细胞形态,普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定.结果 大鼠PASMCs呈典型的“峰-谷”样生长状态,细胞形态呈梭形.α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达,传至第4代的PASMCs成活率可达98％,生长形态未见异常改变.PASMCs细胞从-80℃冰箱中取出复苏后,生长状态良好,形态、结构稳定.结论 用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs,较传统组织块贴壁法更简单,培养效率高.
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人肾癌细胞原代培养方法比较及其生长特性观察
目的:分析比较三种方法分离人肾癌组织原代培养肾癌细胞及其传代能力,探讨建立理想的人肾癌细胞体外实验模型.方法:分别采用组织块贴壁法、机械分散法及差速贴壁分离法、混合酶消化法及差速贴壁分离法进行人肾癌细胞的体外培养,并从细胞形态学、表型、增殖生长曲线和细胞活力曲线等方面进行对比研究.结果:三种方法均可获得原代肾癌细胞,采用组织块贴壁法可获得较多数量的肾癌细胞,采用混合酶消化加分步贴壁后培养情况好,数量较多,形态完整,第4代后肿瘤细胞状态稳定,增殖活跃,有明显的对数生长期,且与肾癌细胞系769-P细胞具有相似的表面抗原表达.结论:采用混合酶消化加分步贴壁法可获得较纯的肿瘤细胞,培养生长时间短,成功率高,适宜体外原代培养.
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组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定
目的 建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法.方法 采用组织块贴壁法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果 90%的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上.镜下可见培养细胞呈典型的"峰-谷"状生长.免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论 组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高.
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改良大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞培养
目的：改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养方法。方法：采用贴壁法+酶消化法培养VSMCs，倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫荧光染色做鉴定。结果：镜下培养细胞呈典型的“谷。峰状”生长，免疫组化染色显示胞浆内a-actin阳性表达。结论：本培养方法简单经济，能利用较少的动物培养出大量高纯度的血管平滑肌细胞，为血管病变的实验研究提供实验材料。
