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ELISA夹心法测定TRPC6蛋白的初步应用研究
目的 初步利用所建立的双抗体ELISA夹心法检测TRPC6蛋白.方法 采用本室制备的单克隆抗体A2和F11,分析为识别不同位点,以佳配对组合建立双抗体ELISA夹心法,并以此方法检测小鼠脑组织中的TRPC6蛋白.结果 确定检测的标准TRPC6多肽浓度区间为1.25-40μg/ml,相关系数R2为0.992,测定小鼠脑组织总蛋白中含有的TRPC6蛋白表达量在1.16μg/ml-1.45μg/ml.结论 所建立的ELISA夹心法可初步用于TRPC6蛋白的检测,为进一步的临床应用提供基础.
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缬沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞相关蛋白 Nephrin 和 TRPC6表达的研究
目的：观察足细胞相关蛋白 Nephrin、TRPC6在糖尿病肾病（DN）大鼠肾小球中的表达，探讨缬沙坦对其干预的可能机制，为 DN 的防治提供理论依据。方法雄性 SD 大鼠40只按体重随机分为正常对照组（NC 组，n=7）、DN 组（n=11）、缬沙坦干预组 H0组、缬沙坦干预组H1组。干预8周后检测大鼠血糖、体重、24 h 尿蛋白、血肌酐、尿肌酐，计算肌酐清除率（Ccr）；免疫组化法观察肾组织 Nephrin、TRPC6的蛋白表达；反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测Nephrin、TRPC6的 mRNA 表达，并进行统计分析。结果（1）与 NC 组相比，DN 组大鼠 Ccr 明显减低、24 h 尿蛋白定量增加（P＜0.05）；与 DN 组相比，H0组及 H1组均出现 Ccr 增加、24 h 尿蛋白定量减少（P＜0.05），与 H0组相比，H1组出现 Ccr 增加、24 h 尿蛋白定量减少（P＜0.05）。（2）与 NC 组比较，DN 组大鼠肾脏 Nephrin mRNA 及蛋白表达均下调，TRPC6 mRNA 及蛋白表达均上调（均 P＜0.05）；与 DN 组比较，H0组及 H1组 Nephrin mRNA 及蛋白表达均上调，TRPC6 mRNA及蛋白表达均下调（均 P＜0.05）；H1组与 H0组比较，Nephrin mRNA 及蛋白表达均上调，TRPC6 mRNA 及蛋白表达均下调（均 P＜0.05）。（3）相关分析：采用直线相关分析后发现，24 h 尿蛋白与肾脏 Nephrin 蛋白及基因表达呈负相关，与 TRPC6蛋白及基因表达呈正相关；Ccr 与肾脏 Nephrin蛋白及基因表达呈正相关，与 TRPC6蛋白及基因表达呈负相关。结论缬沙坦可通过上调 Nephrin的表达及下调 TRPC6表达维持足细胞裂孔膜的完整性，减轻足细胞裂孔膜的损伤，减少蛋白尿产生；在一定剂量范围内，缬沙坦的肾脏保护作用呈剂量依赖性。
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缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾脏TRPC6表达的影响
目的：探讨缬沙坦对糖尿病肾病( DN)大鼠肾脏TRPC6表达的影响。方法高脂高糖喂养联合小剂量链脲佐霉素建立DN模型,将模型大鼠随机分为两组：模型对照组( DN组)与缬沙坦治疗组( DV组),另设正常对照组( NC组)。干预8周末测生化指标及24 h尿蛋白,光镜观察大鼠肾脏病理改变,免疫组化法测肾脏Nephrin、TRPC6表达并作半定量分析。结果与NC组相比DN组大鼠表现为高血糖、高血脂、胰岛素抵抗和蛋白尿,病理出现系膜基质增多,Nephrin表达减低而TRPC6表达增高。经缬沙坦治疗后Nephrin表达增加,TRPC6表达显著降低。 TRPC6与尿蛋白呈正相关, Nephrin的与尿蛋白呈负相关。结论 DN大鼠肾脏出现足细胞损伤和TRPC6表达增加,缬沙坦可通过下调TRPC6的表达而发挥足细胞保护作用。
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抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备及其识别抗原表位分析
目的:制备抗TRPC6多肽单克降抗体,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用TRPC6多肽偶联血蓝蛋白(KLH)为抗原,免疫小鼠后经细胞融合,间接ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞;单克隆抗体亚类检测试剂盒鉴定Ig亚型;间接ELISA 法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力;采用生物信息学进行抗原表位预测,并通过ELISA单抗相加试验分析单抗识别抗原位点的差异性.结果:获得3 株能稳定分泌抗TRPC6多肽的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F11和H8;抗体Ig亚类均为IgG1型;染色体鉴定符合杂交瘤细胞的特性;3株单抗相对亲和力比较F11较强,A2和H8接近;抗体识别位点分析结果表明A2与H8、A2与F11的相加指数分别大于50%,可能识别的是不同位点;而F11与H8的相加指数小于50%,可能识别的是同一位点.结论:抗TRPC6多肽单克隆抗体的成功制备及其识别抗原表位分析,为TRPC6蛋白的相关研究提供物质基础.
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黄芪总苷对TGF-β1诱导下足细胞TRPC6表达的影响
目的:通过观察黄芪总苷对TGF-β1诱导足细胞TRPC6表达的影响,探讨黄芪总苷对足细胞保护作用.方法:体外培养小鼠肾小球足细胞,将成熟的足细胞分为5组:正常对照组、TGF-β1干预组、TGF-β1干预+低剂量黄芪总苷组、TGF-β1干预+中剂量黄芪总苷组、TGF-β1干预+高剂量黄芪总苷组,48 h后MTT检测各组细胞增殖抑制率,Western blot及RT-PCR检测TRPC6蛋白及mRNA表达水平.结果:TGF-β1干预使足细胞足突回缩、甚至消失,抑制足细胞的增殖(P<0.05),提高TRPC6 mRNA和蛋白表达(P<0.05),黄芪总苷能逆转上述变化,对足细胞具有保护作用并且存在一定的量效关系.结论:TPRC6在TGF-β1干预下足细胞损伤作用中起重要作用,黄芪总苷可能通过下调足细胞TRPC6的表达实现对足细胞的保护作用.
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TRPC6在哮喘小鼠肺组织中的表达及其与气道炎症的相关性分析
目的 探讨经典瞬时感受器电位通道(TRPC)6在哮喘小鼠肺组织中的表达情况及其与气道炎症的关系.方法 采用卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘模型,行支气管肺泡灌洗并对灌洗液进行细胞计数和分类,免疫组织化学染色观察肺组织TRPC6与细胞核转录因子(NF)-κB、细胞间黏附分子(ICAM)-1的表达.结果 ①哮喘组支气管肺泡灌洗液中白细胞(WBC)总数和嗜酸粒细胞百分比(EOS％)均明显增高,具有显著差异(P＜0.01);②免疫组化结果发现,哮喘小鼠肺组织TRPC6、NF-κB、ICAM-1蛋白的表达较正常组显著增加(P＜0.01),细胞分布定位具有一致性,主要在支气管上皮细胞和炎症细胞;③相关性分析显示,小鼠肺组织中TRPC6蛋白表达与NF-κB、ICAM-1表达及支气管肺泡灌洗液中WBC总数、EOS％呈显著性正相关(P＜0.05).结论 TRPC6可能与哮喘小鼠肺组织气道炎症有关,从而参与哮喘的发病.
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导致家族性局灶节段性肾小球硬化新基因--TRPC6
蛋白尿是肾脏疾病常见的临床症状之一.近年来,Nephrin、Podocin、CD2AP和α-actinin-4等重要足细胞结构蛋白和细胞骨架分子的确立,为肾小球性蛋白尿发生机制的研究提供了新的思路[1～5].然而,由于蛋白尿临床病理以及遗传背景的异质性,其发生机制尤其是分子机制仍未完全阐明.
关键词： TRPC6 局灶节段性肾小球硬化 -
Calcineurin和TRPC6参与ET-1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖
目的:探讨Calcineurin和瞬时感受器电位6(TRPC6)的相互作用以及对内皮素-1(ET-1)诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响.方法:以ET-1刺激肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)检测Calcineurin活性以及TRPC6的表达;分别于ET-1刺激前给予Calcineurin特异性抑制剂环孢素A(CsA)和TRPC6 siRNA处理,测定Calcineurin活性、TRPC6的表达以及细胞的增殖情况;采用Calcineurin活性检测试剂盒检测其活性,Western blot和RT-PCR检测TRPC6的表达,MTT法检测PASMCs的增殖.结果:ET-1可激活原代培养的PASMCs中Calcineurin的活性,上调TRPC6的表达;CsA和TRPC6 siRNA可以分别降低TRPC6表达和Calcineurin活性;也可以抑制ET-1刺激的PASMCs增殖.结论:Calcineurin与TRPC6参与ET-1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖并相互影响.
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膜性肾病肾活检组织中TRPC6和podocalyxin表达改变及其意义
目的 检测膜性肾病(membranous nephropathy,MN)患者肾活检组织中肾小球足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6,TRPC6)和podocalyxin的表达和分布,探讨足细胞蛋白TRPC6和podocalyxin在MN蛋白尿发生中的作用.方法 采用常规组织病理以及免疫组化检查,并行免疫荧光双套色染色于激光共聚焦显微镜下观察TRPC6、podocalyxin在各组肾组织中表达及分布的改变,以计算机图像分析系统进行半定量分析.结果 对照组肾组织podocalyxin沿肾小球毛细血管壁连续均匀分布,阳性荧光信号表达强,MN组表达减弱,且分布不均或节段性缺失,部分呈点状、短线状不连续分布,肾病综合征组较非肾病综合征组减弱更明显;TRPC6在对照组肾小球有一定的表达,沿肾小球基膜呈均匀连续线型分布,MN组TRPC6荧光强度有不同程度增强,且呈点状、团块状不均匀分布,肾病综合征组较非肾病综合征组更明显.结论 TRPC6和podocalyxin在正常肾组织沿肾小球基膜呈连续线状均匀分布;MN患者肾小球内TRPC6表达增加,podocalyxin表达减少,且分布形式亦发生变化,提示TRPC6和podocalyxin等足细胞相关蛋白表达改变及分布异常可能是MN蛋白尿发生的重要病理机制.
关键词： 膜性肾病 蛋白尿 TRPC6 podocalyxin -
黄芪甲苷对高糖诱导人肾小球系膜细胞损伤的保护作用及其机制
目的研究黄芪甲苷( As-IV)对高糖诱导人肾小球系膜细胞( HMC)损伤的保护作用及其机制。方法用 HMC为目的细胞,实验分为正常对照组、甘露醇对照组、高糖组、Tempol(100μmol/L)组、转化生长因子-β(TGF-β)阻断剂SB431542(10μmol/L)组与 As-IV(25、50、100μmol/L)组。各组细胞培养48 h后,用MTT法检测HMC增殖状况,二氢二氯荧光素( DCFH-DA)法检测细胞内活性氧( ROS)含量, ELISA法检测细胞上清液中 IV 型胶原( Col Ⅳ)的表达, Western blot法检测细胞中转化生长因子-β1( TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4(NOX4)、瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)蛋白的表达。结果与高糖组比较,Tem-pol组、SB431542组、As-IV 25、50、100μmol/L组均能显著抑制高糖诱导的细胞增殖,减少细胞内ROS及上清液中ColⅣ的含量,降低高糖诱导细胞内TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白的高表达,并提高 TRPC6蛋白的表达( P <0.05, P <0.01)。结论 As-IV对高糖诱导HMC损伤具有保护作用,其机制可能与抑制细胞增殖,减少细胞内 ROS 生成,下调TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白的表达及上调TRPC6蛋白的表达有关。
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参杖颗粒含药血清对HepG2细胞增殖及TRPC6表达的抑制效应
目的 探讨参杖颗粒对人肝癌细胞株(HepG2)增殖的抑制作用与分子机制.方法 将正常血清、TRPC6通道阻滞剂及参杖颗粒含药血清分别培养各组HepG2,应用流式细胞术检测各组细胞周期;应用western blot检测各组TRPC6蛋白表达;应用RT-PCR方法检测各组TRPC6 mRNA表达.结果 药物血清组与正常对照组比较,HepG2细胞周期明显阻滞于G1期(P＜0.05),药物血清组HepG2的TRPC6蛋白表达下调(P＜0.05)、TRPC6mRNA表达下调(P＜0.05).结论 参杖颗粒含药血清能有效抑制HepG2增殖,其机制与降低TRPC6蛋白的表达相关.
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瞬时受体电位通道蛋白 TRPC6表达与前列腺癌临床特征的相关性研究
目的：：探讨前列腺癌中瞬时受体电位通道蛋白 TRPC6的表达与其临床病理特征之间的相关性。方法：收集22例良性前列腺增生石蜡组织标本和118例前列腺癌石蜡组织标本，采用免疫组织化学染色技术检测 TRPC6蛋白的表达，运用 SPSS 17.0软件分析 TRPC6蛋白表达水平与前列腺癌病人的临床病理特征的相关性。结果：TRPC6蛋白在前列腺癌组织样本中的表达相比前列腺良性增生组织样本明显上调(P <0.05)；TRPC6蛋白的高表达与前列腺癌病人高的 T、N 分期及 Gleason 评分呈正相关(P <0.05)。结论：TRPC6蛋白的高表达与前列腺癌发生和恶性演进显著相关。
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TRPC6与肾脏疾病
瞬时受体电位阳离子通道(transient receptor potential channel,TRPC)作为瞬时受体电位(transientreceptor potential,TRP)超家族中的一员,是一种非选择性的离子通道,在人体的各种组织、器官和细胞中均有表达.TRPC6基因突变致局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS),从而揭示了TRPC通道.尤其TRPC6与肾脏疾病的密切关系.TRPC6突变可引起细胞内钙离子浓度升高,也可直接影响肌动蛋白细胞支架组织,这些都是导致肾脏疾病的机制.
关键词： TRPC6 肾脏 足细胞 蛋白尿 局灶节段性肾小球硬化 -
TRPC6与肾脏疾病关系的研究进展
瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)是由 TRPC6 基因编码的瞬时受体超家族成员之一,在人体内各组织或器官广泛表达,在肾小球足细胞也有表达.TRPC6与podocin、nephrin、ACTN4及CD2AP等多种裂孔隔膜(SD)蛋白相互作用共同维系肾小球足细胞的结构及功能.多因素作用导致肾小球足细胞损伤引起 SD 的足突融合是肾脏疾病主要的形态学改变.该文就 TRPC6 生物学功能及其对肾脏疾病的影响作一简述.
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迟发性家族性局灶节段肾小球硬化的足细胞分子基因突变研究
目的 了解迟发性家族性局灶节段肾小球硬化(FSGS)的足细胞分子基因致病突变特点.方法 研究对象为上海瑞金医院肾脏科1997年9月至2007年10月收集的31个迟发性家族性FSGS家系.诊断标准:(1)成员年龄大于12岁;(2)1个家系中有2例或2例以上患者经肾活检证实为FSGS,或家系成员中有1例肾活检证实为FSGS,另有1例成员有蛋白尿或肾功能不全.100 例健康人为对照组.外周血基因组DNA经PCR扩增后直接对NPHS2、ACTN4、TRPC6基因行测序分析.结果 发现ACTN4基因新错义突变L316P,该家系患病成员起病年龄平均(38.7±7.4)岁,肾功能损害进展相对缓慢,家系3例患病成员均为突变杂合子.发现TRPC6基因新杂合错义突变Q889K,该家系患者起病年龄平均(38.0±4.2)岁.肾功能损害进展也较缓慢,家系中临床表现存在个体差异,家系中3例患病成员均为突变杂合子.发现TRPC6静止突变G467G.所有家系中未发现NPHS2致病突变.健康对照组200条染色体亦未发现以上突变.结论 在31例迟发性FSGS家系中发现2个家系携带致病相关突变:ACTN4新突变L316P和TRPC6新突变Q889K.在中国人群家族性迟发性FSGS中,ACTN4及TRPC6基因突变是致病原因之一,尚未发现NPHS2相关致病突变.
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瞬时受体电位阳离子通道蛋白6合成肽的设计与合成
目的 预测瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)的抗原表位特性,筛选合适的TRPC6氨基酸序列合成多肽,用于制备抗TRPC6合成肽单克隆抗体.方法 根据TRPC6氨基酸序列,采用IEDB分析及蛋白质软件(Lasergene710 WinInstall)分析,预测TRPC6表面性、抗原性、亲水性及可能的二级结构性质,以此筛选合成多肽序列.结果 确定合成多肽为TRPC6的胞外段565-579氨基酸序列,其表露性预 测值1.000；柔韧性预测值1.008；β-转角预测值1.022;抗原性预测1.034；亲水性预测2.043.结论 所确定的TRPC6多肽序列表位预测符合要求,为TRPC6合成肽制备抗单克隆抗体提供了一条有效的途径.
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儿童激素耐药型肾病综合征TRPC6基因变异分析
目的 研究和探讨儿童激素耐药型肾病综合征(SRNS)TRPC6基因变异情况及其临床特点.方法 收集南方地区30例SRNS患儿和30例正常儿童的病例资料及外周血,提取外周血基因组DNA.PCR扩增TRPC6基因全部外显子,直接测序后与NCBI基因数据库进行比对,对两组之间基因分布差异进行统计学分析.结果 在所有受试者中均未检测到TRPC6基因的突变.3例SRNS患儿检测到TRPC6外显子7单核苷酸多态性:423C>T.两组研究对象间单核苷酸多态性的基因分布差异无统计学意义(P>0.05).结论 TRPC6基因外显子7单核苷酸多态性:423C>T可能不是本研究中SRNS患儿发病的遗传学基础.
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全反式维甲酸对肾小球硬化大鼠肾小球TRPC6表达的影响
目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对大鼠肾小球瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)表达的影响.方法:雄性Wistar大鼠60只,随机分成假手术组、GS组、ATRA组,每组20只,干预12周后处死大鼠.电镜下观察肾小球超微结构改变.免疫组织化学方法检测肾脏组织TRPC6、TGF-β1、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的蛋白分布及表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肾脏组织TRPC6 mRNA的表达,免疫印迹法(WB)方法检测肾小球TRPC6的蛋白表达.结果:与GS组相比,ATRA组大鼠GSI显著下降(P＜0.01),肾小球TRPC6、TGF-β1、Col-Ⅳ的蛋白表达量显著下降,TRPC6的mRNA表达量显著下降(P＜0.05).结论:ATRA可能通过抑制肾小球TRPC6的表达而减轻GS进展.
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TRPC6在TGF-β1诱导的体外培养肾小球足细胞损伤中的表达及其高表达对nephrin、desmin表达的影响
目的 体外研究经典瞬时受体电位通道6(TRPC6)在TGF-β1诱导的肾小球足细胞损伤中的表达变化及其高表达对足细胞nephrin、desmin表达的影响.方法 以肾小球足细胞株(MPC5)为研究对象,以不同质量浓度(0、4、8、12 ng/ml)TGF-β1刺激足细胞,干预72 h后用免疫荧光、Real-time PCR、Wstern blot检测TRPC6的分布及mRNA和蛋白表达.再将MPC5细胞分组,应用12 ng/ml TGF-β1处理各组细胞,分别于0、24、48、72 h应用免疫荧光、Real-time PCR、Western blot检测TRPC6的分布及mRNA和蛋白表达.用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体pEX-3-TRPC6及对照质粒空载体pEX-3-NC转染足细胞,48 h后应用Western blot检测转染后TRPC6蛋白水平评估传染效率;同时应用免疫荧光、Real time RT-PCR及Western印迹方法检测转染后nephrin、desmin分布及表达的变化.结果 与正常对照组相比,倒置显微镜下TGF-β1干预后足细胞足突融合、回缩,当TGF-β1增加至16 ng/ml时足突甚至消失.TGF-β1作用能使足细胞TRPC6表达及分布发生变化,当TGF-β1质量浓度为4 ng/ml,干预72 h后与对照组相比TRPC6 mRNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当TGF-β1质量浓度提高到为8、12 ng/ml时TRPC6 mRNA和蛋白含量明显升高(P＜0.05),并呈剂量依赖性.应用12 ng/ml干预24 h,与对照组相比,TRPC6mRNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当干预时间延长至48、72 h时TRPC6 mRNA和蛋白含量明显升高(P＜0.05),并呈时间依赖性.pEX-3-TRPC6转染48 h后足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P＜0.05),nephein分布未发生变化,但表达量在mRNA及蛋白水平分别下降25％及42％左右(P＜0.05),desmin分布发生改变,表达量在mRNA及蛋白水平分别升高132％及116％左右(P＜0.05).结论 TGF-β1可诱导足细胞TRPC6分布变化且表达上调,TRPC6高表达可影响nephrin、desmin表达及desmin的分布,这可能是TRPC6参与足细胞损伤的机制之一.
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抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备抗TRPC6多肽单克降抗体,并对其免疫学和生物学特性进行鉴定.方法 采用TRPC6多肽偶联血蓝蛋白(KLH)为抗原,免疫Balb/c小鼠,取血清效价高者脾细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞进行融合.采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,以及测定单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力；采用单克隆抗体亚类检测试剂盒鉴定Ig亚型；并经有限稀释法克隆化培养获得杂交瘤细胞株；采用秋水仙素阻断法鉴定杂交瘤细胞株染色体.结果 获得3株能稳定分泌抗TRPC6多肽的单克隆抗体,分别命名为A2、F11和H8;抗体Ig亚类均为IgG1型,染色体均在89±7条的范围内；相对亲和力结果F11为6μg/ml,A2、H8为12.5μg/ml.结论 抗TRPC6多肽单克隆抗体的成功制备,为TRPC6的免疫学检测方法的建立奠定基础.
