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构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体
目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.
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构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌
目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌.方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pllac的lac启动子下游,得到质粒pllac-pZP3α.将质粒pllac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5 μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中.筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失.结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pllac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌.结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达.
关键词： 卵透明带抗原-3α(pZP3α) 乳酸杆菌 免疫避孕 同源重组 疫苗 -
特别时期特别避孕
目前应用的避孕方法很多.从种类上来讲,有药物、工具、手术、安全期、体外排精及免疫避孕等.根据药物使用途径不同,又可分为口服、注射、外用、皮下埋植等.就避孕效果而言,还有永久、长效和短效之分;就性别而言,有男用及女用之分.
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滋养层细胞促融合表位肽抗生育作用的初步研究
目的 合成多价抗原肽,观察其体液免疫效果,并初步评估其抗生育潜力.方法 选择人滋养层细胞促融合表位模拟肽与一种通用辅助T细胞表位(PADRE)作为骨架,合成多价抗原肽(MAP)结构的免疫原,与等量弗氏佐剂混悬后免疫雌性C57BL/6小鼠,观察体液免疫反应的特点及抗血清干扰滋养细胞融合的效果.结果 在431A 固相自动肽合成仪上成功地合成了MAP多肽, 并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95%以上;其在小鼠血清中诱导出的特异性抗体的滴度高达1∶1 024,且可以特异识别滋养层细胞相关抗原表位;在1∶10 稀释的抗血清存在时,forskolin诱导的人绒癌细胞(BeWo)间融合显著减少(P＜0.01).结论 由含有人滋养层细胞促融合表位模拟肽、具有特异性氨基酸序列的新抗原所制备的抗血清可识别滋养层细胞相关天然抗原表位, 并在小鼠体内激发出较理想的特异性体液免疫, 同时,抗血清对BeWo细胞间融合具有一定抑制作用.
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以小鼠精子/睾丸特异性抗原为基础的合成肽免疫避孕效应研究
目的研制以精子/睾丸特异性抗原为基础的多价嵌合肽避孕疫苗.方法选择小鼠精子/睾丸特异性抗原Sp17、 Cyritestin 作为对象,采用分子设计的方法与外源性牛核糖核酸酶非选择性T细胞表位组合合成新型嵌合肽-35肽,并对其免疫效应进行研究.结果该嵌合肽可刺激小鼠产生较高效价的血清和阴道粘膜特异性抗体,诱导脾脏淋巴细胞增殖,促进细胞因子IL-4的分泌;将其与佛氏佐剂混悬,免疫雌性BALB/c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔率,其抗血清可显著抑制体外精-卵结合和融合.结论新型嵌合肽具有较明确的抗生育作用,提示以分子设计、蛋白质优化方案进行多价避孕疫苗的研究是可行的.
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以精子为靶标的避孕疫苗研究进展
精子是避孕疫苗极具前景的靶标.研究者先后发现了不少抗精子疫苗的候选分子,但这些疫苗候选抗原在动物试验中都仅能部分阻断或降低生育力.大量研究正在试图找出真正适合的精子特异性表位,并增强其免疫原性及免疫避孕效果.
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犬卵透明带3(CZP3)DNA疫苗免疫有效降低小鼠生育能力
目的 构建以犬卵透明带3(CZP3)为靶抗原的DNA避孕疫苗,并对其免疫效果及抗生育能力进行初步评价.方法 提取犬卵巢总RNA,反转录PCR扩增CZP3基因,利用ProtScale、TMHMM、Signal P、InterProScan、PREDICT PROTEIN、同源模建等生物信息学方法对CZP3基因进行分析,构建携带目标抗原CZP3的DNA疫苗pcDNA-CZP3,进行小鼠免疫实验,对DNA疫苗的免疫效果、抗生育水平进行综合评价.结果 CZP3基因序列共编码426个氨基酸,其在N端和C端各有1个疏水区,N端前22个氨基酸为信号肽,C端有1个由细胞外到细胞内的跨膜螺旋.CZP3有8个B细胞表位.DNA避孕疫苗pcDNA3-CZP3能够诱导小鼠产生较高的抗体水平,免疫组小鼠平均产仔数显著低于空白对照组和阴性对照组.结论 成功构建能显著降低小鼠生育能力的犬避孕DNA疫苗pcDNA3-CZP3.
关键词： 犬卵透明带3(CZP3) 序列分析 DNA疫苗 免疫避孕 -
精子表面的GPI锚定蛋白
糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇结构锚定于真核细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层的蛋白.精子上的GPI-APs是一类重要的精子表面蛋白,已报道的有十几种,功能多样,在精子的发生、成熟、获能、受精以及免疫保护等方面起着重要作用.这类蛋白有些可能是某些男性不育症潜在的诊断和治疗靶点,有些则是有前景的免疫避孕候选靶标.
关键词： 糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白 GPI-APs 精子 免疫避孕 -
近年国内计划生育药物研究概况
自六十年代甾体口服避孕药在我国推广应用以来,三十年中我国计划生育药物的研究和生产取得了很大进展.国内已可生产一系列避孕药供选用.剂型有口服、注射、皮下埋植和外用.对甾体避孕药的研究近年主要在作用机理、减少副作用和长期用药安全性等方面.就药物而言,更多注意到中药和植物药的研究.内容包括男性和外用药.本文综述了1995年以来国内该领域研究工作的进展.鉴于免疫避孕至今尚未进入避孕药行列,故未包括在本文内.
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HER-2/neu胞外区的基因工程表达及其免疫避孕作用
目的:研究HER-2/reu胞外区部分片段重组蛋白疫苗在免疫避孕中的作用.方法:构建原核表达重组体pET-hECDu,在大肠杆菌中表达人HER-2/neu胞外区部分片段,经Hi-Trap亲和层析柱纯化得到重组蛋白(hECDu),以ELISA法检测其结合活性后免疫雌性小鼠.用ELISA法检测抗HER-2/neu体液免疫应答,3H-TdR掺入法检测细胞免疫应答.结果:经原核表达系统成功纯化得到与理论分子量77 ku(1 u=1 Da)相符的hECDu,并证实其可与抗HER-2/neu胞外区特异性单克隆抗体结合.该重组蛋白疫苗可诱导雌鼠产生较高水平体液及细胞免疫应答.其生育力(平均产仔数4.0±1.8)与对照组(7.8±1.3)相比明显降低,但免疫鼠产后4 d子宫及卵巢均无明显病理改变.结论:经原核表达系统成功纯化得到HER-2/neu胞外区部分片段重组蛋白,该蛋白疫苗可在小鼠中诱导产生免疫避孕效应.
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人绒毛膜促性腺激素(hCG)避孕疫苗临床研究概况
目的:人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)是近30年发展免疫避孕疫苗的首选抗原.以hCG的全β亚基为免疫原和以C末端109～145的37个氨基酸肽段为免疫原研制的避孕疫苗,通过了临床前的毒性与安全性试验,并完成了第一期、第二期临床试验.本文介绍hCG避孕疫苗在国际上的临床研究以及我国临床前预初试验的概况.
关键词： 人绒毛膜促性腺激素(HCG) 避孕疫苗 免疫避孕 -
pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响
背景与目的:精卵融合是发生在受精过程中的重要生物学事件,Izumo是位于顶体内膜上的I型免疫球蛋白,是一种具有精子特异性的膜蛋白,在精卵融合中起关键作用.我们研究pCXN2-mIZUMO在小鼠C57BL/6肌肉中的表达及对其生育能力的影响,为进一步研究免疫避孕手段提供实验依据.材料与方法:用重组质粒pCXN2-mIZUMO分别免疫雌和雄性C57BL/6小鼠.ELISA测定小鼠体内的抗Izumo抗体水平,检测小鼠抗血清在体外受精中对受精率的影响,被免疫的雌性、雄鼠分别与正常的雄、雌鼠交配,雌雄合笼比例为2:1,分娩完成后统计其产仔数.结果:pCXN2-mIZUMO可以在小鼠体内诱发抗Izumo特异性免疫应答.被pCXN2-mIZUMO免疫后的小鼠抗血清在体外能够降低其受精率;各组产仔数分别为:实验雌鼠组2.9±0.66;对照雌鼠组5.4±0.82;实验雄鼠组5.1±0.99;对照雄鼠组6.0±1.34.实验雌鼠组的生育能力比对照雌鼠组明显降低(P＜0.05).结论:重组质粒pCXN2-mIZUMO免疫雌性小鼠具有降低生育能力的作用.
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重组小鼠Izumo的表达及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响
背景与目的:精子膜蛋白Izumo在精卵融合中起关键作用.本研究旨在表达和纯化重组小鼠Izumo蛋白(mIzumo),探讨重组mIzumo在小鼠体内的免疫原性及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响.材料与方法:将编码mIzumo蛋白的cDNA序列亚克隆到pET28a(+)原核表达载体上,构建pET28a(+)-mIzumo重组质粒.在BL21(DE3)大肠杆菌中表达重组6His-mIzumo融合蛋白,并通过Ni2+亲和层析纯化.使用福氏佐剂乳化纯化的6His-mIzumo,分别免疫雌性和雄性C57BL/6小鼠,并采集免疫前和免疫后血清.用Western Blot和ELISA检测血清中抗6His-mIzumoIgG抗体的特异性和滴度.采用IVF和精卵融合试验检测血清中抗6His-mIzumo抗体对小鼠精卵融合的影响.结果:纯化的6His-mIzumo在SDS-PAGE凝胶上显示为约60 kD的单一条带.免疫了重组蛋白的雌性和雄性小鼠都产生了抗6His-mIzumoIgG抗体.抗6His-mIzumoIgG抗体与重组蛋白,小鼠睾丸、附睾及精子膜蛋白存在交叉反应,免疫印迹显示为约60kD的特异性条带.ELISA结果表明,免疫6His-mIzumo后至少6周之内,血清中的抗6His-mIzumoIgG抗体维持在高水平.免疫后血清处理组的小鼠精子与去透明带卵母细胞发生胞膜融合的能力明显低于免疫前血清处理组(P＜0.01).结论:纯化的6His-mIzumo融合蛋白能够诱发雌性和雄性小鼠产生可阻断精卵融合发生的特异性血清抗体.因此,6His-mIzumo可作为同种异体抗原用于免疫避孕候选疫苗的研究.
