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离子对高效液相色谱法测定人体红细胞内核苷二磷酸激酶活性

沈如飞;刘亚妮;曾繁典;师少军

摘要: 目的:建立测定人体红细胞(RBC)内核苷二磷酸激酶( NDPK)活性的反相离子对高效液相色谱法.方法:稀释RBC中加入反应底物(dADP和dGTP)及其他反应混合液后,37℃孵育5 min,100℃灭活10 min,离心取上清液进样分析.以反应产物dATP定量分析NDPK活性.色谱柱为SymmetryShield TM RP18(150 mm×3.9mm,5μm),检测波长为260 nm,柱温为25℃;采用梯度洗脱,流动相A为20 mmol·L-1 KH2 PO4-K2 HPO4缓冲液、加入离子对试剂5mmol· L-1四丁基硫酸氢铵(TBAHS)溶液,流动相B为乙腈.结果:NDPK催化反应dADP+ dGTP←→dATP+ dGDP反应特异性良好,RBC内dATP的线性范围为4.33~43.34 μmol·L-1(r2=1.000),定量下限为4.33 μmol·L-1.日内及日间RSD分别小于5.53%和6.69%,准确度为98.4%~104.2%,平均绝对回收率大于83%;dATP样品在室温或4℃、- 80℃保存30d及反复冻融3次稳定性良好.结论:该法操作简便快速、灵敏、专属性强,可应用于人体RBC内NDPK活性测定,为研究NDPK活性与嘌呤类药物反应相关性提供基础.

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