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曼陀罗子对小鼠L5178Y细胞TK基因的致突变作用
目的：研究曼陀罗子对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用。方法将培养的小鼠淋巴瘤L5178Y细胞在代谢活化和非代谢活化条件下，分别以62.5，125，250，500μg/mL的曼陀罗总碱或625，1250，2500，5000μg/mL的氢溴酸东莨菪碱处理3 h后，弃细胞上清液，并加入DMEM培养基继续培养48 h。然后将细胞接种于含三氟胸苷的96孔板，计数各组的突变细胞集落数。结果与对照组比较，在代谢活化和非代谢活化条件下，62.5，125，250，500μg/mL的曼陀罗总碱和625，1250，2500，5000μg/mL的氢溴酸东莨菪碱均未见诱导L5178Y细胞突变率的增加。结论62.5~500μg/mL的曼陀罗子总碱和625~5000μg/mL的氢溴酸东莨菪碱对小鼠L5178Y细胞TK基因无致突变作用。
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PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响
目的:探讨PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响.方法:构建重组质粒PEGFP-AFP-TK并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的肝癌细胞SMMC7721.转染12 h后,于荧光显微镜下动态观察;48 h后,RT-PCR和Western blot分析HepG2细胞巾HSV-TK基因的表达情况,用MTT法检测HepG2细胞的存活,用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡.结果:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转入HepG2细胞,并且其转染效率高于脂质体;RT-PCR及Western blot证明转染的HepG2细胞有HSV-TK基因的表达;MTT及流式细胞分析说明HSV-TK基因发挥杀伤细胞作用.结论:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转染HepG2细胞并获得表达,PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK可显著抑制HepG2细胞增殖,可望成为肝癌基因治疗的新型生物制剂之一.
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含rPB-DR启动子和TK基因的重组腺病毒的构建和鉴定
目的构建含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为前列腺癌基因治疗的研究奠定基础.方法应用分子克隆技术,将rPB-DR启动子连接至pBluescript SK-TK上构建出pBluescript SK-rPB-DR-TK,再酶切出rPB-DR-TK目的片断,并将其连接至穿梭质粒pShuttle上.将构建好的pShuttle-rPB-DR-TK经Pme Ⅰ单切线性化后再以电穿孔法转化至E.coli.BJ 5183-AdEasy-1内进行同源重组,抽提质粒经卡那抗性筛选及酶切鉴定正确的即为pAd-rPB-DR-TK,再经Pac Ⅰ酶切回收后以脂质体法转染人胚肾293细胞,包装出完整腺病毒,然后大量扩增测定滴度,并行PCR鉴定.结果经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了包含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒pAd-rPB-DR-TK,包装、扩增后测病毒滴度为1.1×108 TCID50/ml.结论成功构建出包含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步前列腺癌基因治疗的研究中.
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TK基因在异基因骨髓移植后GVHD防治中的应用
将TK基因导入T淋巴细胞从而将更昔洛韦(GCV)在T淋巴细胞内代谢为毒性产物进而杀伤T淋巴细胞的疗法,在控制移植物抗宿主病(GVHD)中开辟了新的途径.细胞的自杀机制是该疗法的基础,可用于GVHD效应细胞分析及确定输注供体T淋巴细胞的安全阈量,此法在GVHD防治中有良好的研究前景及临床应用价值.
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酚噻嗪类光敏剂YWW007用于病原体灭活的毒性评价研究
目的 探讨酚噻嗪类光敏剂YWW007应用于血液病原体灭活的安全使用剂量.方法 细胞毒性试验:使用YWW007终浓度为1、4、12、20、40 μmol/L培养基培养小鼠成纤维细胞,用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)方法检测细胞存活率;遗传毒性评价:采用YWW007终浓度为1、2、4、6、8、12 μmoL/L的培养基培养小鼠淋巴瘤细胞,用微孔板法做tk基因突变试验,计算平板效率、相对存活率以及TFT抗性突变频率等指标.结果 当YWW007浓度达到40 μmol/L时,具有明显的细胞毒性;而YWW007浓度为12、4、2和1μmol/L时,细胞存活率＞70％,提示细胞毒性轻微;YWW007浓度≤4 μmol/L时,在含有和不合有代谢活化系统(S9)条件下,其突变频率(MF)值均未达到阴性对照组MF值的2倍,未见剂量-效应关系.结论 YWW007浓度≤4 μmoL/L为用于病原体灭活的安全剂量.
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TK基因治疗肿瘤的研究现状
自杀基因治疗法是肿瘤基因治疗中的重要方法.该法采用药物敏感基因转染肿瘤细胞,导致肿瘤细胞死亡,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的.目前研究多的自杀基因是TK基因.本文就TK基因在肿瘤基因治疗中的研究现状作一简单终述.TK基因治疗肿瘤具有广阔的前景,随着研究的深入,TK基因治疗将成为人类攻克肿瘤的有效方法.
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纳米磁流体介导的重组pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性肝癌细胞HepG2的杀伤作用的体外实验
目的: 探讨纳米磁流体介导的重组质粒pEGFP-AFP-TK对AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2的杀伤作用.方法:通过纳米磁流体将构建好的重组质粒pEGFP-AFP-TK 并分别转染AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2 及AFP表达阴性肝癌细胞SMMC-7721,于荧光显微镜下动态观察;使用RT-PCR和Western blot分析HepG2 细胞中TK 基因的表达情况,MTT法检测转染重组TK表达质粒后的细胞在更昔洛韦(GCV)作用下的存活率并观察旁观者效应,用流式细胞术分析HepG2细胞的凋亡.结果:纳米磁流体能将重组质粒pEGFP-AFP-TK转入AFP阳性的HepG2 细胞,其转染效率高于脂质体;RT-PCR 及Western blot证明转染的AFP阳性的HepG2 细胞有TK基因的表达;MTT 及流式细胞术分析说明TK基因发挥杀伤细胞作用.结论:纳米磁流体能将重组质粒pEGFP-AFP-TK转染HepG2细胞并获得表达,可作为肝癌基因治疗的基因载体,采用AFP增强子可使目的基因在HepG2 细胞中特异性表达,并且在前药GCV的作用下,能使AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2发生凋亡及旁观者效应.
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survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达
目的:构建survivin基因启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶(human simplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)真核表达载体,检测其在人喉癌细胞中的表达.方法:PCR克隆survivin基因启动子与tk基因,双酶切后分别插入pCI-neo真核表达载体中,酶切鉴定后用脂质体法转染喉癌细胞(Hep-2)和正常细胞(7702),RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况.结果:成功构建了survivin启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/survivin-tk;并通过RT-PCR检测出survivin启动子调控的表达载体在喉癌细胞中有表达,而在正常细胞中无明显表达.结论:survivin启动子具有肿瘤特异性,有可能解决喉癌基因治疗中的特异性杀伤问题.
关键词： Survivin基因 启动子 喉癌 Tk基因 -
hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用
目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.
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腺病毒介导HSV-tk/GCV系统杀伤脑胶质瘤C6细胞
目的: 观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟甘(herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir--HSV-tk/GCV)系统对脑胶质瘤细胞的杀伤作用. 方法: 将AdCMVLacZ感染胶质瘤细胞C6,X-gal染色,测定腺病毒的转染率. AdCMVtk感染C6细胞后加入10 mg*L-1 GCV,观察肿瘤细胞存活率及旁观者效应. 结果: tk基因对C6细胞的转染率随着腺病毒的感染复数(MOI)量增加而增加(r=0.819, P<0.05),100%转染所需要的MOI为100. AdCMVtk/GCV对C6细胞的杀伤强度与AdCMVtk的量成正相关(r=0.870, P<0.05). 此杀伤作用存在旁观者效应,且较强. 结论: 腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统具有杀伤脑胶质瘤的作用.
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更昔洛韦对转染TK基因的人骨髓瘤细胞的生长抑制作用及旁观者效应
目的：探讨更昔洛韦对转染TK基因的骨髓瘤细胞生长的抑制作用。方法：应用缺陷型反转录病毒介导的TK基因系统(RV-HSV-TK)转染骨髓瘤细胞，采用细胞增生实验(MTT法)，研究更昔洛韦对转染TK基因的骨髓瘤细胞株的抑制作用。结果：转染了TK基因的骨髓瘤细胞的生长曲线与未转染TK基因的细胞无差异。0.1 μg／mL50μg／mL的更昔洛韦对转染TK基因的骨髓瘤细胞有明显的抑制作用，且与更昔洛韦的作用时间成正比。将转染阳性细胞与未转染细胞共孵育，加入10μg／mL的更昔洛韦作用96 h，可见旁观者效应。结论：采用RV-HSV-TK系统转染骨髓瘤细胞，有较高的转染率，转染了TK基因的骨髓瘤细胞对更昔洛韦敏感。
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WI-L2家族人类淋巴母细胞TK基因突变研究
WI-L2家族主要包括有TK6、WTK1、TK6-E6三种细胞株,其TK(Thymidine kinase,TK)基因均为杂合型(TK+/-),但P53状态各不相同.三种细胞的TK基因突变实验广泛用于P53功能研究.考虑到三种细胞培养简单而且是人类来源,目前该试验也逐步应用于多种物质遗传毒性检测.三种细胞的TK试验的差异丰富了对毒作用表现形式的认识,也为探讨遗传毒作用机制提供了崭新的视角,是遗传毒性研究中很好的生物材料.因此对三种细胞的TK实验差别及其相关研究做了简要综述.
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tk基因突变的分子机制研究
胸苷激酶 (Thymidine kinase, tk)基因突变试验是对外源性化学物质进行遗传毒性检测的短期试验方法.该方法可检测出染色体 tk位点的点突变、基因缺失以及染色体畸变等多种类型的遗传损伤.遗传毒性物质作用于 tk位点产生大、小两种突变体,对应着不同的突变机制.杂合子丢失的产生机制和 P53基因的作用机制是近年来研究的热点.
