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纳米SiO2引起肝细胞自噬功能紊乱的研究
目的 研究纳米二氧化硅(SiO2)对肝细胞自噬功能的影响.方法 以人肝癌细胞HepG2为模型,分为对照组和SiO2处理组.用透射电子显微镜观察SiO2粒子的大小、形貌和分散性.细胞处理24 h后,透射电子显微镜观察自噬体的超微结构;激光共聚焦显微镜观察LC3B蛋白在细胞内的分布;Western blot检测SiO2不同剂量处理组中自噬标志蛋白LC3B和p62的表达水平.用自噬抑制剂氯喹预处理,检测SiO2对自噬流的影响.结果 透射电子显微镜结果显示SiNPs粒子大小均匀,形貌良好,分散性好,未发生聚集,平均粒径为58.25±7.4 nm.透射电子显微镜下观察到SiO2处理组的细胞内有大量自噬体;激光共聚焦显微镜下观察到SiO2处理组的细胞内出现LC3B的点状聚集;HepG2细胞中LC3B和p62的蛋白表达水平随SiO2处理剂量的增加而升高,并且高剂量SiO2阻断了细胞自噬流.结论 SiO2诱导HepG2细胞发生自噬,促进自噬体的产生;SiO2阻断自噬流,抑制自噬体的降解;从而导致自噬体的积累,引起肝细胞自噬功能紊乱.
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调控自噬流对巨噬细胞粘附与迁移功能的影响
目的 巨噬细胞浸润是包括糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在内的多种慢性肾脏疾病的重要组织病理特征.本研究通过调控巨噬细胞(RAW264.7)自噬流各阶段,探究其对巨噬细胞黏附迁移功能的影响.方法 体内实验,建立糖尿病肾病大鼠模型,于12周末分别处死正常大鼠、DN组大鼠,病理染色观察肾脏病理改变,检测肾组织巨噬细胞标志物及自噬相关标志物表达.体外实验,检测正常与高糖(30 mM)条件下,巨噬细胞自噬体数量变化,LC3、Beclin-1(自噬相关标志物)、P62(自噬体清除指标)的表达,以及巨噬细胞粘附迁移数量.分别加用自噬溶酶体降解抑制剂氯喹(CQ)、自噬体生成激活剂雷帕霉素(RAPA),观察其对巨噬细胞自噬标记物表达及其粘附迁移功能的影响,电镜观察巨噬细胞自噬体数量与自噬溶酶体形态的变化.结果 体内实验,DN大鼠肾脏损伤明显,肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织CD68(巨噬细胞标志物)、P62表达增加(t =3.35、t=16.27,P＜0.05),LC3表达减少(t=51.12,P＜0.05);体外实验,在高糖组,电镜观察发现自噬体数量较正常组减少,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高(t=27.02,t=45.56、=32.71,P＜0.05),巨噬细胞粘附和迁移数量增多(t=6.87、t=8.76,P＜0.05).用CQ处理后,电镜观察发现巨噬细胞自噬体溶酶体降解受到抑制,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高(t=14.64、t=12.45、t=8.57,P ＜0.05);CQ进一步促进高糖诱导的巨噬细胞黏附迁移数量增多(t=4.37、t =7.27,P＜0.05);RAPA增加巨噬细胞自噬体数量,Western与免疫荧光显示RAPA提高了被高糖抑制的巨噬细胞自噬水平,[LC3、Beclin-1表达升高,P62表达降低(t=9.37、t=11.53,=8.73;P ＜0.05)],减少高糖诱导的巨噬细胞黏附、迁移数量增多(=4.16、=5.74,P＜0.05).结论 高糖抑制自噬水平,促进巨噬细胞黏附迁移;抑制自噬溶酶体降解可降低自噬水平、促进巨噬细胞粘附迁移;激活自噬体生成能提高自噬水平,减轻巨噬细胞粘附迁移.
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原花青素介导的自噬流对喉癌细胞增殖影响及其机制探讨
目的 原花青素(procyanidins,OPC)通过抑制细胞周期、促进凋亡等机制发挥抗肿瘤作用.本研究旨在探讨OPC介导的自噬流对喉癌TU686细胞增殖活力的影响,并进一步探究OPC促进喉癌TU686细胞自噬流可能的分子机制.方法 单丹磺酰尸胺(dansylcadaverine,MDC)染色法及流式细胞术检测不同浓度OPC对TU686细胞自噬的诱导作用;蛋白质印迹法检测TU686细胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表达变化;并从翻译水平检测相关Atg蛋白表达,使用SiRNA干扰Atg5基因,并采用q-PCR和蛋白质印迹法检测干扰后Atg5转录和翻译水平变化,进一步检测干扰Atg5对LC3Ⅱ和p62影响;检测PI3K/AKT途径中活化PI3K p85α和磷酸化P-AKT1蛋白表达情况,采取PI3K/AKT途径激动剂胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)与OPC共培养细胞的方式以阐明PI3K/AKT途径在OPC诱导的自噬流中具体作用.CCK-8法和台盼蓝染色法检测OPC诱导的自噬流对TU686细胞增殖活力影响.结果 OPC处理组(20～40 μg/mL) LC3-Ⅱ相对蛋白表达量高于0加药组,F=1 688.710,P＜0.001;p62相对蛋白表达量低于0加药组,F=73.875,P＜0.001.40 μg/mL OPC作用后Atg5和Atg12蛋白相对表达量分别为3.20±0.08和7.52±0.13,高于0加药组,F值均为-3.079,P值均为0.012;40μg/mL OPC作用后PI3K p85α和P-AKT1蛋白相对表达量分别为0.18±0.01和0.48±0.06,低于0加药组,F值均为3.079,P值均为0.012.IGF 1可以逆转OPC引起的LC3-Ⅱ升高和p62降低,与CON组相比,OPC组、IGF-1组和OPC+ IGF-1组LC3-Ⅱ相对表达量分别为10.32±0.31、1.02±0.20和5.73±0.11,均P＜0.001;p62相对表达量分别为0.64±0.02、1.03±0.02和0.87±0.01,均P＜0.001.3-MA预处理后可以逆转OPC引起的LC3-Ⅱ和p62变化,与CON组相比,OPC组、3-MA组和OPC+ 3-MA组LC3-Ⅱ蛋白相对表达量分别为4.74±0.10、1.05±0.13和1.81±0.05,均P＜0.001;p62蛋白相对表达量分别为0.59±0.02、0.94±0.03和0.78±0.03,P值分别为＜0.001、0.002和＜0.001.SiRNA干扰Atg5后,抑制OPC引起的LC3-Ⅱ和p62变化,与NC相比,NC+OPC组、Si-Atg5组和Si-Atg5+OPC组中LC3-Ⅱ相对表达量分别为9.43±0.36、1.14±0.11和6.08±0.22,均P＜0.001;p62相对表达量分别为0.28士0.02、1.03±0.02和0.68±0.02,均P＜0.001.CCK-8结果显示与CON组相比,OPC组、3-MA组和OPC+ 3-MA组细胞活力分别为(49.53±4.29)％、(95.29±1.80)％和(67.19±0.31)％,P值分别为＜0.001、0.001和＜0.001.与CON组相比,NC+ OPC组、Si-Atg5组和Si-Atg5+ OPC组细胞活力分别为(49.53±4.29)％、(100.44±0.50)％和(73.01±1.23)％,均P＜0.001.结论 OPC可能通过抑制PI3K/AKT途径促进喉癌TU686细胞自噬流的通畅,并抑制TU686细胞增殖活力.
关键词： 原花青素 PI3K/Akt通路 喉癌 自噬流 -
自噬活性物质筛选系统研究进展
细胞自噬是近年来生物医学领域的研究热点,参与机体的多种生理及病理过程.自噬参与多种疾病的发生发展,以自噬为靶点的药物开发亦成为新的研究热点.随着对自噬研究的深入,如何对该过程进行精确的定性、定量研究以及如何通过实验手段干预自噬进程仍为现阶段研究的重点.同时,利用自噬的定量研究方法建立自噬活性筛选系统可对自噬活性物质进行筛选鉴定,为针对多种疾病的临床药物开发提供候选化合物.本文总结了多种自噬活性筛选系统的建立原理和方法.
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自噬流的检测方法
自噬是调节真核细胞生长、死亡和能量代谢的重要生物学机制.细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的活化.大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病,特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关,目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点.由于自噬流是一个由多个步骤组成的动态过程,因此往往需要精细的实验才能准确判断自噬流状态.本文将介绍自噬流的基本概念并总结目前常规使用的自噬流检测方法.这些方法将有助于自噬生物学机制的研究,并为自噬相关药物筛选提供有效的解决方案.
关键词： 自噬流 流式细胞术 串联荧光 长寿命蛋白 微管结合蛋白1A/1B-轻链3 -
姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用
目的 探讨姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用.方法 5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理AGS细胞24h,采用MTT法观察姜黄素对AGS胃癌细胞增殖的抑制作用,Western blot检测姜黄素对微管相关蛋白LC3和泛素相关蛋白SQSTM1/p62蛋白表达的影响.Western blot检测自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用对LC3和SQSTM1/p62蛋白表达的影响.结果 MTT结果显示,姜黄素可以明显抑制AGS胃癌细胞的增殖,并且呈剂量依赖性(P ＜0.05,P＜0.01).Western blot结果显示,随着姜黄素浓度的增加,LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白的表达均呈剂量依赖地上调(P ＜0.05,P＜0.01),提示姜黄素可以引起自噬体的堆积.自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用可以增强LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白表达的上调,进一步验证了姜黄素对自噬流的抑制作用.结论 姜黄素可能通过阻滞人AGS胃癌细胞自噬体降解,抑制AGS胃癌细胞的自噬流,促进AGS胃癌细胞的死亡.
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大麻二酚通过促进自噬流减轻棕榈酸诱导的肝细胞损伤
目的 观察大麻二酚(CBD)对棕榈酸(PA)诱导的肝细胞损伤的保护作用,并考察其与自噬流相关的潜在机制.方法 原代培养大鼠肝细胞,分别给予1 μmol/L和5μmol/L的CBD处理24 h,采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62的表达,考察CBD对细胞自噬的影响.将细胞分为4组并分别给予不同处理:PA组(800μmol/L PA处理细胞)、PA+CBD组(800 μmol/L PA和5μmol/L CBD联合作用)、PA+CBD+CQ组[800 μmol/L PA、5μmol/L CBD和50 nmol/L自噬抑制剂氯喹(CQ)共同作用]和阴性对照组(加入等体积0.03％ DMSO处理细胞),每组作用时间均为24 h;采用蛋白质印迹法检测LC3和p62的蛋白表达,流式细胞术考察细胞凋亡情况,qPCR法检测内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和X盒结合蛋白1(XBP-1) mRNA的表达,Rh123和lucigenin荧光探针分别检测线粒体的膜电位和活性氧簇(ROS)含量.结果 1μmol/L和5μmol/L CBD均不影响肝细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值以及p62蛋白的表达.与阴性对照组相比,PA组肝细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白表达增加(P＜0.05),细胞凋亡增加(P＜0.05),CHOP、GRP78、XBP-1 mRNA表达增加(P＜0.05),线粒体膜电位降低(P＜0.05),线粒体ROS的生成增加(P＜0.05);与PA组相比,PA+CBD组肝细胞内的自噬流恢复,细胞凋亡减少,内质网应激和线粒体失常减轻(P＜0.05);同时给予CQ处理可以逆转CBD的保护作用(P＜0.05).结论 CBD能够通过促进自噬流减轻PA诱导的肝细胞损伤,改善内质网应激和线粒体功能.
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AMPK信号通路调控的自噬在七氟烷后处理保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的机制研究
研究七氟烷后处理对在体大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用,探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的自噬流在七氟烷后处理心肌保护中的作用.成年雄性SD大鼠50只,建立急性大鼠在体心肌I/R损伤模型.随机分为5组:假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟烷后处理组(SP组)、Compound c溶剂二甲基亚砜组(DMSO组)、AMPK抑制剂Compound c组(Com c组).除Sham组,其余各组缺血30 min,再灌注4h末.再灌注4h末,提取心脏,采用氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)测定心肌梗死范围.采用免疫印迹法(Western blot技术)检测p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62蛋白表达水平.与I/R组比较,SP组心肌梗死范围减小,p-AMPK/t-AMPK蛋白表达上调而LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达下调(P＜0.05);与SP组比较,Com c组心肌梗死范围增加,p-AMPK/t-AMPK蛋白表达下调而LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调(P＜0.05).DMSO组相比于SP组差别无统计学意义(P＞0.05).七氟烷后处理减轻了在体大鼠心肌I/R损伤,其机制可能是通过激活AMPK信号通路,减少再灌注期间自噬体的蓄积,保护自噬流进而发挥保护作用.
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4-PBA抑制内质网应激降低间质性膀胱炎大鼠膀胱兴奋性
目的 探讨内质网应激在大鼠间质性膀胱炎发病过程中的作用,以及4-PBA的治疗价值.方法 45只雌性SD大鼠按随机数字表法分为3组:对照(C)组、炎症(IC)组和炎症+4-PBA(IC+4-PBA)组,每组15只.C组用生理盐水处理;IC组用鱼精蛋白联合LPS诱导;IC+ 4-PBA组由炎症模型建立时予以内质网应激抑制剂4-PBA处理.5d后应用Western blot分别测定内质网应激标记物(GRP78)、自噬流标记物(P62)、自噬标记物(LC3A/B、Beclin1)的表达量;免疫荧光检测膀胱LC3A/B的表达;HE染色检测膀胱组织病理学变化;尿动力学检测膀胱功能改变.结果 IC组GRP78、P62、LC3A/B、Beclin1表达显著高于C组(P＜0.05);4-PBA+IC组GRP78、P62、LC3A/B、Beclin1表达显著低于IC组;免疫荧光结果显示IC+ 4-PBA组LC3A/B表达显著低于IC组且高于C组(P＜0.05);HE染色结果显示IC+ 4-PBA组膀胱上皮组织完整性,炎细胞浸润和组织水肿程度都较IC组明显改善;在膀胱功能学上,IC+ 4-PBA组大鼠较IC组排尿频率显著降低,排尿间隔显著延长.结论 在鱼精蛋白联合LPS诱导的大鼠间质性膀胱炎模型中,使用4-PBA抑制膀胱内质网应激恢复自噬流有可能降低膀胱兴奋性,改善膀胱功能.
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穿膜肽TAT修饰的自噬诱导肽Beclin1抗肿瘤的初步研究
目的 研究自噬诱导肽Beclin 1及其经穿膜肽TAT修饰后所得TAT-Beclin 1对乳腺癌的体外自噬诱导作用及体内外疗效.方法 采用透射电子显微镜、eGFP-LC3细胞转染技术和蛋白免疫印迹法综合对比评价Beclin 1和TAT-Beclin 1对4T1细胞自噬流的影响,通过体外细胞毒性和体内抑瘤实验评价其抗肿瘤疗效.结果 TAT-Beclin 1能显著提高Beclin 1在4T1细胞上的自噬诱导能力;TAT-Beclin 1在体内具有一定的抗4T1肿瘤能力.结论 TAT-Beclin 1较Beclin 1能更有效地诱导自噬并发挥治疗乳腺癌的效果.
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自噬研究的新动向-自噬流
自噬是目前生物医学领域研究热点之一，广泛参与各种生理和病理过程。既往对自噬的研究多以自噬体的多少评价自噬水平的强弱，新近发现自噬体的增加并不能从本质上反映自噬的水平，仅仅能够反映自噬的诱导，或者自噬体清除的抑制。因为从自噬流的角度来看，自噬体的数量受形成和清除两方面影响，准确全面地评估自噬不仅包括自噬体的检测，还包括动态观察整个自噬流的过程是否通畅。我们提倡结合使用多种自噬检测方法以获取可靠数据，将动态和静态检测方法结合，更能有效说明细胞自噬的发生以及自噬流的变化。
