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彗星试验检测硫芥对淋巴细胞DNA损伤的研究
硫芥(sulfur mustard)作为化学战剂使用已有80余年的历史,由于它具有高度的化学活性和广泛的生物学作用,迄今仍未失去"毒剂之王”的重要地位.硫芥是双功能烃化剂,攻击的主要靶分子是DNA,能引起DNA链断裂,导致细胞死亡[1].近年来,流行的DNA损伤与修复的检测方法--彗星试验,利用单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis;SCGE)技术检测单个细胞DNA断裂,可直接观察单个细胞的DNA损伤,该试验具有诸多优点[2].为此,本研究应用彗星试验探索硫芥对人、鼠、犬淋巴细胞DNA的损伤规律,为寻找硫芥中毒早期敏感的观察指标,为临床诊断提供新技术、新方法[3].
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硫芥对犬外周血淋巴细胞DNA损伤的作用
硫芥是典型的双功能烃化剂,进入体内后产生烃化作用,攻击的主要靶分子是DNA.目前,单细胞凝胶电泳(SCGE)技术发展很快,国内、外将该法作为DNA损伤检测的基本方法之一.先前我们用此法进行硫芥对人外周血淋巴细胞DNA损伤的体外实验[1],本次选用犬外周血淋巴细胞,观察体内、外硫芥染毒后DNA损伤的剂量效应与时间效应关系,为寻找研究硫芥细胞毒性作用及中毒早期敏感的检测方法提供实验依据.
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硫芥诱导大鼠脾脏淋巴细胞凋亡的研究
目的 探讨硫芥诱导脾脏组织淋巴细胞凋亡以及caspase-3在其中的作用.方法 大鼠腹腔注射硫芥,各组动物分别于中毒后1、3、5d后麻醉,开胸取脾.HE染色法观察脾脏组织的病理改变,RT-PCR法检测大鼠脾脏组织caspase-3基因表达,West-em blot法检测caspase-3的蛋白表达.分离脾脏淋巴细胞,制备硫芥染毒细胞模型.DNA琼脂糖凝胶电泳观察caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对细胞DNA降解的影响;流式细胞仪检测Ac-DEVD-CHO对染毒细胞凋亡峰(即G1亚G1峰)及线粒体跨膜电位(△Ψm)的影响.结果 硫芥中毒大鼠脾脏组织形态发生病理改变,部分淋巴细胞出现了凋亡的特征;脾脏组织caspase-3的mRNA与蛋白表达均增加:mRNA在中毒后1d的表达量与对照组比较具有统计学意义(P＜0.05);蛋白表达在中毒后3d和5d与对照组比较具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).caspase-3的特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO对体外培养的硫芥染毒淋巴细胞的DNA降解和细胞(G1峰左侧凋亡峰的m现有抑制作用.硫芥可导致细胞线粒体跨膜电位降低,随着中毒时间延长,线粒体膜电位的降低更明显.结论 硫芥中毒可导致大鼠脾脏组织损伤,细胞凋亡是其作用机制之一,caspase-3可能参与了这一过程并在其中发挥重要的作用.
关键词： 硫芥 脾 淋巴细胞 凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 -
硫芥中毒损伤作用机制的研究进展
硫芥是一种糜烂性毒剂,作用于皮肤产生红斑、水疱、坏死,并能引起眼、呼吸道、消化道黏膜的组织损伤,吸收到体内后出现程度不同的全身中毒.目前尚无特效抗毒剂.研究认为其作用机制可能为:DNA烃化和糖酵解的抑制、蛋白硫醇-Ca2+稳态失调、谷胱甘肽(GSH)的消耗、活性氧(reactive oxygen substances, ROS)的产生等.细胞凋亡也是近年来其毒理作用机制研究的热点.本文综述了近年来该领域的研究进展,以期为我们寻找、制定有效的预防和治疗措施提供一些重要的启示.
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硫芥的毒作用机制研究进展
硫芥是一种糜烂性化学战剂,能直接损伤组织细胞,引起局部炎症,吸收后导致全身中毒.为此,从核酸、蛋白质、自由基、细胞因子等分子水平对其毒作用机制进行了研究.硫芥对组织细胞的损伤是多方面的,烃化损伤DNA是基础,并从不同途径影响蛋白质和酶的合成、结构及功能,消耗谷胱甘肽,使自由基生成增加,电子传递链中断,损伤线粒体,促炎性细胞因子生成.硫芥的毒作用机制目前仍不完全清楚.当前,对硫芥中毒的治疗方案主要是:(1)硫芥清除剂;(2)预防和逆转烃化造成的附加生化结果.
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硫芥诱导淋巴细胞凋亡与细胞周期的关系
目的探讨硫芥诱导体外培养大鼠脾脏淋巴细胞凋亡及与细胞周期的关系.方法体外分离培养大鼠脾脏淋巴细胞.以流式细胞仪、琼脂糖凝胶电泳分别检测细胞凋亡,细胞周期,和DNA片段改变.结果硫芥可诱导淋巴细胞凋亡(P＜0.05),对细胞周期有明显影响,主要是S期和G2/M期明显降低,引起淋巴细胞生长阻滞在G1期;流式细胞仪PI染色出现亚二倍体峰(凋亡峰),其G1期DNA含量明显增加,S期含量减少;琼脂糖凝胶电泳呈典型的"梯状"带(DNA ladder).结论硫芥可抑制体外培养的淋巴细胞由G1期进入S期,抑制体外培养的淋巴细胞增殖,通过诱导淋巴细胞凋亡实现作用机制.
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硫芥中毒防治药物及其作用机制的研究进展
本文综述了有关硫芥损伤的防治药物如钙离子通道阻滞剂、多(ADP-核糖)聚合酶抑制剂、精氨酸结构类似物、谷胱甘肽、半胱氨酸及其酯类等的可能防护机制,展望了这几种药物的发展前景.认为硫芥损伤是多因素、多途径的,因而其药物防治也应是综合性的.
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硫芥对大鼠止血和凝血功能的影响
目的:研究硫芥中毒对大鼠的止、凝血功能的影响机制.方法:建立大鼠硫芥中毒模型,注射1/4LDs0硫芥7 d后测定血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLC)、有核细胞计数(NC)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维结合蛋白(FN)、纤溶酶(Plm)等指标.结果:硫芥组及各治疗组大鼠Hb、PLC、NC明显低于对照组.硫芥中毒组大鼠血清FN低于对照组,EPO加用四药治疗组FN明显高于硫芥中毒组和其他治疗组.硫芥中毒组APTT、PT均比其他各组延长.结论:硫芥中毒可导致大鼠PLC、Hb、FN减少及内、外源凝血功能降低;促红细胞生成素(EPO)对FN合成有促进作用.
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硫芥对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA的损伤及还原型谷胱甘肽的保护作用
目的 研究硫芥对中国仓鼠肺成纤维细胞(Chinese hamster fibroblast cell line,CHL)DNA的损伤作用及还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的保护作用.方法 将CHL分为2组,均以10、100、1 000 μmol/L硫芥染毒,其中1组以10 mmol/L的GSH加以保护,分别在不同时间点(即刻,6、24、48、72 h)收集细胞进行单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis assay,SCG)检测.结果硫芥染毒组CHL的DNA迁移率和迁移度在染毒后6、24、48、72 h均显著高于相应时刻的生理盐水组和溶剂对照组(P＜0.01).GSH保护组DNA迁移率和迁移度亦显著增高(P＜0.01),但较之单纯硫芥染毒组DNA迁移率下降了13.0%～52.5%,迁移度亦显著下降.结论 硫芥对CHL的DNA有损伤作用,呈时间、剂量关系.GSH对DNA的损伤有一定保护作用.
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氧自由基在大鼠硫芥中毒复合烧伤小肠损伤中的影响
目的 探讨氧自由基在硫芥中毒复合烧伤对大鼠小肠损伤中的作用.方法 SD大鼠随机分为对照组、单纯硫芥中毒组、30%TBSAⅢ度烧伤组、中毒复合烧伤组,观察动物致伤后2、6、12、24、48、72 h血浆二胺氧化酶(DAO)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、回肠组织病理学的改变情况.结果 单纯及复合伤均导致动物外周血中SOD活力明显下降(P＜0.01),MDA含量、DAO活性显著上升(P＜0.01),复合致伤组与单纯烧伤以及单纯中毒组有明显差异(P＜0.01);致伤后小肠组织结构损伤明显,损伤程度与损伤时间呈正相关,复合伤组的改变较相同时相点单纯损伤组明显.结论 硫芥全身中毒早期,小肠即受到损伤,在复合烧伤的情况下所导致的该损伤更为严重,氧化应激反应也更为剧烈.提示自由基与硫芥中毒复合烧伤对大鼠小肠的损伤关系密切.
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还原型谷胱甘肽对抗硫芥诱导大鼠脾淋巴细胞毒性作用
目的观察还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)对硫芥(sulfur mustard,SM)诱导大鼠脾淋巴细胞线粒体功能的保护作用.方法用密度梯度离心法分离大鼠脾淋巴细胞,与硫芥共同进行体外培养.用MTT法检测线粒体功能状态;用荧光分光法检测细胞内GSH含量和用琼脂糖DNA凝胶电泳观察DNA的损伤.结果硫芥作用的线粒体功能变化具有剂量和时间依赖性,它与细胞内GSH含量下降呈直线正相关(P＜0.01).使用GSH后,对不同剂量组的线粒体功能早期均有保护作用.保护效果好时间的DNA断裂情况有所减轻,甚至可以逆转坏死向凋亡发展.结论GSH可部分保护线粒体功能.
关键词： 硫芥 淋巴细胞 GSH 线粒体功能 DNA Ladder -
硫芥诱导L5178Y细胞tk基因突变的研究
目的检测硫芥对小鼠淋巴瘤L5178Y3.7.2c-tk+1-细胞的诱变性.方法采用96孔微孔板接种法检测平板接种效率和突变频率.结果硫芥可诱导L5178Y3.7.2c-tk+1-细胞tk位点的突变,诱发突变是自发突变的2～15倍.在tk位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落,以小克隆为主.结论硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒性,产生了大范围的DNA损伤.
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硫芥对大鼠脾脏淋巴细胞线粒体的损伤作用
目的观察硫芥对大鼠脾脏淋巴细胞线粒体的损伤作用.方法用密度梯度离心法分离大鼠脾淋巴细胞,与硫芥共同进行体外培养.用琼脂糖DNA凝胶电泳观察细胞凋亡的发生;用Western blot观察Cyt-c释放.用MTT法检测线粒体功能状态,以罗丹明123标记的荧光探针检测线粒体跨膜电位.结果 100 μmol/L硫芥作用4 h线粒体功能就有降低,线粒体跨膜电位降低,二者间呈直线相关.硫芥中毒早期即可引起淋巴细胞线粒体细胞色素C释放和细胞凋亡(DNA ladder).结论硫芥可引起大鼠脾淋巴细胞线粒体明显损伤,线粒体参与了硫芥的细胞毒性作用过程.
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低剂量硫芥诱导大鼠脾脏氧化应激状态的改变
目的探讨低剂量硫芥诱导大鼠脾脏氧化应激状态的改变及其意义.方法皮下注射硫芥,梯度离心法分离大鼠脾线粒体.用紫外分光光度法检测ROS、SOD、MDA及细胞色素含量;荧光分光法检测细胞内GSH含量;HE染色法观察脾脏病理损伤.结果低剂量硫芥作用下,脾脏出现水肿;组织和线粒体内ROS、SOD、MDA、GSH、GSSG含量出现不同程度的改变;线粒体电子传递链成分(细胞色素)含量出现不同程度的丢失.结论氧化应激状态的改变是低剂量硫芥诱导机体免疫器官(脾)损伤的毒作用机制之一.
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硫芥诱导小鼠染色体畸变和微核形成作用的研究
目的研究硫芥对中国仓鼠肺成纤维细胞(chinese hamsterfibroblast cell line,CHL)染色体的诱变作用及对小鼠骨髓微核率的影响.方法培养CHL细胞(±S9),以不同浓度硫芥处理24h后常规方法制备染色体,观察畸变类型并计算畸变率.KM小白鼠皮下注射硫芥染毒,24h后处死动物,取双侧股骨,行骨髓涂片和姬姆萨染色,计数含微核嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte,PCE)数.结果硫芥处理的CHL细胞染色体畸变率显著增加,出现裂隙、断裂、缺失、多倍体等多种类型畸变,并呈量效依赖趋势.S9不影响硫芥诱导的CHL细胞染色体畸变形式和畸变率.与对照组比较,注射硫芥小鼠骨髓PCE微核率显著增加(P＜0.01),硫芥剂量越大,微核形成率越高.结论硫芥能直接诱发细胞染色体损伤.
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硫芥对大鼠淋巴细胞谷胱甘肽含量的影响
目的探讨硫芥中毒后淋巴细胞谷胱甘肽含量变化.方法用密度梯度离心法分离大鼠脾淋巴细胞,与硫芥共同进行体外培养.用MTT法测定细胞活力.以荧光分光光度计法测定细胞还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG)含量变化,结果淋巴细胞活力在硫芥中毒后降低水平与细胞内GSH含量呈直线相关关系.硫芥中毒8 hGSH含量开始下降,8～12 h维持在低水平,24～48hGSH进一步下降;GSSG含量24～48h显著低于对照水平;GSH/GSSG比值在8 h后显著降低.结论硫芥中毒淋巴细胞活力与谷胱甘肽含量的变化存在显著相关性.
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四肽AC-DEVD-CHO对硫芥诱导淋巴细胞凋亡的干预作用
目的探讨caspase-3活性在硫芥诱导淋巴细胞凋亡中的变化和其四肽抑制剂AC-DEVD-CHO对细胞凋亡的干预作用.方法荧光分光光度法检测caspase-3活性变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分别检测DNA ladder,细胞凋亡率.结果硫芥可诱导淋巴细胞caspase-3活性升高,其多肽抑制剂可部分阻断细胞凋亡,主要表现在抑制剂作用下DNA ladder现象减弱,细胞凋亡百分数下降.结论硫芥通过激活caspase-3诱导淋巴细胞凋亡,其多肽抑制剂对淋巴细胞凋亡具有干预作用.
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硫芥淋巴细胞毒性作用与caspase-3表达
目的探讨硫芥对淋巴细胞的毒性作用方式和分子机制. 方法利用硫芥诱导的体外培养淋巴细胞,采用荧光分光光度法检测DNA 的损伤,运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和 Western blot方法检测胱氨酸蛋白酶c aspase-3的基因和蛋白表达及活化.结果硫芥可导致淋巴细胞DNA损伤,Caspase-3在基因水平和蛋白水平上表达增加,同时发生活化作用,具有时间依赖效应 .结论硫芥通过caspase依赖途径诱导淋巴细胞毒作用,Caspase-3的表达与活化参与该过程,影响着淋巴细胞的毒性作用.
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硫芥中毒犬外周血IL-2、IL-6含量变化和淋巴细胞DNA损伤
目的研究硫芥中毒犬外周血IL-2、IL-6变化和淋巴细胞DNA损伤的规律.方法重庆家犬硫芥中毒(16 mg/kg,sc).中毒后不同时相点取血,分离血清和淋巴细胞.采用放射免疫方法测定血清中IL-2、IL-6含量,以单细胞凝胶电泳技术测淋巴细胞DNA损伤程度.结果中毒后4 h血清IL-2、IL-6含量开始下降,72 h达低值,120 h开始恢复.单细胞电泳检测结果提示,硫芥导致明显的淋巴细胞彗星现象.受损细胞率、淋巴细胞DNA片段迁徙度于中毒4 h即开始升高,24～72 h持续升高.结论硫芥中毒导致发生早且持续时间较长的犬外周血IL-2、IL-6含量下降和淋巴细胞DNA损伤.
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硫芥对大鼠淋巴细胞DNA及白细胞介素的影响
目的探讨硫芥中毒动物淋巴细胞的损伤特点及中毒早期白细胞介素的浓度变化作为硫芥毒性损伤诊断的可能性. 方法分离大鼠脾淋巴细胞培养,经10～1000 μmol*L-1芥子气染毒30 min,以单细胞凝胶电泳法(SCG)检测DNA损伤;同时测定硫芥中毒大鼠血液IL-2和IL-6浓度. 结果中毒后淋巴细胞DNA迁移率和受损细胞百分率呈时间和剂量依赖关系(r=0.63, P<0.01);培养液中IL-2和IL-6浓度明显降低, IL-6含量为(468±16) μg*L-1,4 h开始下降,72 h降至(177±16) μg*L-1 (P<0.01),120 h有所回升,但仍然明显低与对照(P<0.01). 其中IL-2几乎难以检出. 结论硫芥中毒早期机体免疫系统受到明显抑制,SCG检测DNA损伤用作评价硫芥细胞毒性指标在诊断方面具有一定价值.
