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河豚毒素抗毒疫苗载体蛋白的选定
河豚毒素(TTX)是高毒性的小分子神经性毒素,因其分子量小,需与大分子载体蛋白共价偶联成人工抗原,才具有免疫原性.为提高疫苗效价,本文比较了5种载体蛋白对免疫效果的影响.
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河豚毒素抗毒疫苗不同免疫方案的免疫效果比较
以河豚毒素(TTX)与中国鲎血蓝蛋白(TTH)的化学偶联物TTX-TTH免疫BALB/c小鼠.在免疫总剂量(450μg)相同时,比较长(L)、短(S)不同免疫时间间隔(分别为14～20天和7～10天)对疫苗有效时间的影响,以血清抗体质量和抗TTX攻毒效果检验疫苗的效价.结果发现,S组比L组的抗体质量升速更快.L和S两组抗毒效价比较:首次免疫后一年内,15次(15×LD)攻毒,平均存活率分别为92.9%和99.3%(P＜0.01);半数动物存活时间分别为首次免疫后11.3和14.6个月.说明TTX的实验疫苗不同免疫方案均有效预防了TTX的攻毒,但短间隔比长间隔免疫产生更优的抗体质量,具有更高的抗毒时效性.
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鬼臼毒素人工抗原的合成与鉴定
目的合成和鉴定鬼臼毒素人工抗原,以获取具有特异性和高度亲和性的鬼臼毒素多克隆抗体.方法通过酯化反应合成半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯;利用活泼酯法和混合酸酐法偶联成免疫和包被所需的人工抗原;按常规免疫法,从免疫的兔血清中获取高效的抗鬼臼毒素抗体.结果质谱、核磁共振和红外分析表明两种不同方法均成功地合成了半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯.人工抗原的偶联比因载体蛋白和合成方法的不同而有所不同,Hapten-BSA1为88.6,Hapten-BSA2为40.3,Hapten-OVA1为17.8和Hapten-OVA2为54.2.利用兔M4440产生的抗血清建立的ELISA方法对鬼臼毒素的低检测浓度为0.12 μg·mL -1,半数抑制浓度为2.21 μg·mL -1.结论成功地合成了鬼臼毒素人工抗原,并获得了抗鬼臼毒素抗体,为鬼臼毒素免疫分析方法的进一步研究提供了条件.
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滥用药物丁丙诺啡人工抗原的合成
目的:利用化学方法将丁丙诺啡半抗原与载体蛋白偶联制备丁丙诺啡人工抗原.方法:结构修饰后的丁丙诺啡半抗原与载体BSA蛋白经过戊二醛法联接合成丁丙诺啡人工抗原,利用紫外光谱扫描法、蛋白质电泳法和胶体金免疫层析法进行检测.结果:丁丙诺啡人工合成抗原联接成功,胶体金免疫层析检测结果显示,合成抗原与抗体有特异性反应,具有活性,交叉反应良好.结论:该方法合成的丁丙诺啡抗原可作为丁丙诺啡免疫用抗原和丁丙诺啡免疫检测方法建立所用包被抗原.
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人参皂苷Re人工抗原的合成及单克隆细胞株的筛选
目的 合成并鉴定人参皂苷Re(GRe)人工抗原,用于单克隆抗体的制备.方法 采用高碘酸钠氧化法合成人参皂苷Re人工免疫抗原(GRe-BSA)和人工包被原(GRe-OVA);利用薄层色谱法及紫外光谱法鉴定人参皂苷Re人工免疫抗原和人参皂苷Re人工包被原;利用人参皂苷Re人工免疫抗原多次免疫BALB/c小鼠后,通过间接ELISA法测定免疫小鼠抗血清的效价和特异性.采用PEG法诱导小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,有限稀释法进行单克隆细胞株的筛选.结果 紫外光谱和薄层色谱法检测结果表明,人参皂苷Re与BSA/OVA偶联成功;小鼠抗血清效价大于1∶60 000,竞争抑制曲线表明,血清中的抗人参皂苷Re抗体可与人参皂苷Re产生特异性结合.有限稀释法筛选出能分泌抗人参皂苷Re抗体的单克隆细胞株2F4-3H10.结论 成功合成了人参皂苷Re人工免疫抗原和人参皂苷Re人工包被原,并可诱发小鼠产生相应特异性抗体;筛选出了人参皂苷Re单克隆细胞株,可用于腹水的大量制备及免疫组化技术的建立.
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柴胡皂苷a人工抗原的合成及免疫原性鉴定
目的 合成柴胡皂苷a(SSa)免疫抗原和包被抗原,为柴胡皂苷a单克隆抗体的制备及免疫分析方法的建立奠定基础.方法 采用高碘酸钠氧化法分别合成柴胡皂苷a免疫抗原(SSa-BSA)和包被抗原(SSa-PLL);用紫外光谱和薄层色谱法鉴定人工抗原是否偶联成功,并免疫小鼠,通过ELISA方法测定血清中抗体效价,通过间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测抗体特异性.结果 薄层色谱法检测结果显示柴胡皂苷a与BSA/PLL偶联成功.小鼠经SSa-BSA免疫后,体内可产生抗柴胡皂苷a抗体,效价1:80 000以上.结论 与其他人工抗原的鉴定方法相比,薄层色谱法具有独特的优势.成功合成的柴胡皂苷a人工抗原可用于下一步的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立.
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栀子苷人工抗原的合成与鉴定
目的 为建立栀子苷的免疫学分析方法,首先合成栀子苷的人工完全抗原.方法 采用高碘酸钠氧化法分别合成栀子苷免疫抗原(GEN-BSA)和包被抗原(GEN-PLL).结果 优化了栀子苷抗原的合成条件,经紫外光谱检测栀子苷成功与BSA/PLL偶联,偶联比可达到11∶1,免疫小鼠后血清抗体效价达到1∶12 800.结论 成功合成栀子苷完全抗原,可用于下一步单克隆抗体的制备.
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Tb-NT-P-BSA抗原在结核病血清诊断中的初步评价(论著摘要)
继麻风杆菌酚糖酯抗原在麻风病血清诊断中广泛应用之后,1987年又发现了结核杆菌的酚糖酯抗原.依据两种疾病同属分支杆菌病这一前提,也将其用于结核病的血清诊断.80年代末、90年代初合成了结核杆菌酚糖酯人工抗原,即将结核杆菌酚糖酯抗原中所具有的独特的三糖结构通过结合臂连接于牛血清蛋白(BSA)上,以下简称Tb-NT-P-BSA.该抗原的合成成功,为抗原的来源提供了保障,且具有水溶性、价格低廉等优点.但其在临床上的应用价值,学者们尚未达成共识.现将笔者对该抗原的初步评价结果报道如下.Tb-NT-P-BSA抗原由日本奈良大学Fujiwara教授提供.用ELISA法检测了40份痰菌阳性(涂片)结核患者血清标本和52份正常人血清标本.结果表明:本方法的特异性、敏感性分别是:在检测抗Tb-NT-P-BSAIgG抗体时为94.2%和20%;在检测抗Tb-NT-P-BSA IgM抗体时为79.6%和45%.IgG优于IgM.但该抗原的特异性、敏感性、特别是后者不理想,有待于进一步改进.按笔者的经验,在麻风人工合成抗原中,独特的三糖以NT-O-的形式与BSA联接的特异性比以NT-P形式联接者高,可以借鉴这方面的经验,其次,IgM与IgG类抗体同时检测则能在保持特异性的基础上较大幅度提高敏感性,从而可提高现有方法的实用价值.
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壬基酚人工抗原及多克隆抗体的制备
目的 制备壬基酚人工抗原和多克隆抗体,为采用免疫学方法检测壬基酚做准备.方法 利用碳二亚胺(DCC)法制备人工抗原,并用紫外扫描法初步验证,用所制备的人工抗原对家兔免疫制备多克隆抗体,并用ELISA法检测抗体滴度.结果 初步验证人工抗原中壬基酚与匙孔嘁血蓝蛋白的结合比为18:1,ELISA法测定抗体效价为1:32 000.结论 用碳二亚胺法成功合成了壬基酚人工抗原,并获得了较高效价的多抗血清,制备壬基酚多克隆抗体所用的时间不足3 d.
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毒死蜱人工抗原的合成与分析
目的 制备毒死蜱人工抗原,为建立其酶联免疫吸附检测方法提供技术储备.方法 以毒死蜱为原料,在弱碱性条件下与3-巯基丙酸反应,合成半抗原O,O-二乙基-O-[3,5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫代磷酸酯之后,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)通过EDC方法合成人工抗原,前者为免疫原,后者为包被原,并对其进行质谱鉴定.结果 合成的半抗原分子量为419.7,与理论值(420)一致.免疫原中毒死蜱半抗原与蛋白BSA的偶联比为13:1,包被原中毒死蜱半抗原与蛋白OVA的偶联比为5:1.结论 成功合成毒死蜱的半抗原和人工抗原,为建立检测毒死蜱的ELISA方法奠定了基础.
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甲基对硫磷单克隆抗体的研制及鉴定
目的研制甲基对硫磷(M1605)单克隆抗体(McAb).方法人工抗原M1605-TTH免疫BALB/C小鼠,用被免疫的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在融合剂PEG4000作用下融合.经过HAT培养液选择性培养、间接ELISA法筛选和有限稀释克隆后,鉴定该杂交瘤细胞株和McAb.结果获得2株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株G12、H02,其培养液和腹水滴度为1:103和1:105.进一步研究G12发现,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108,其McAb分类为IgM,该McAb的亲和力常数为1.67×105L/mol,且具有较好的特异性.结论获得抗M1605的特异性McAb,为建立M1605简便、快速、特异的生物检测方法提供了必要条件.
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无色孔雀石绿人工抗原的制备及免疫原性鉴定
目的 用免疫分析法检测水产品中无色孔雀石绿(LMG)的残留,研究LMG人工抗原及其多克隆抗体的制备和鉴定.方法 通过混酸硝化还原法对LMG进行改造,获得氨基无色孔雀石绿(NH2-LMG),然后采用改良的碳二亚胺法制备LMG完全抗原.用该人工抗原免疫动物,获得多抗血清.采用酶联免疫法测定抗体效价.选择与LMG结构相似的5种药物进行交叉反应,计算交叉反应率.结果 经紫外光谱及电泳法检测,LMG与载体蛋白偶联成功,偶联比为1∶17.利用该抗原免疫小鼠后获得了效价高于104的抗LMG抗体,交叉反应结果表明该抗体有较好的特异性.结论 成功合成了LMG人工抗原,为进一步制备LMG单克隆抗体及研究LMG的新型、快速检测方法奠定了基础.
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人参皂苷Rg1人工抗原的合成及免疫原性鉴定
目的 合成人参皂苷Rg1的人工免疫原和包被原,为后续制备人参皂苷Rg1的单克隆抗体及建立相应的免疫分析方法奠定基础.方法 采用NaIO4氧化法分别合成人参皂苷Rg1免疫抗原(Rg1-BSA)和包被抗原(Rg1-PLL);紫外光谱和薄层色谱法鉴定人工抗原偶联是否成功;用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价,用间接竞争ELISA检测抗体特异性.结果 经紫外光谱和薄层色谱法检测,人参皂苷Rg1与BSA/PLL偶联成功;免疫小鼠后Rg1-BSA可以使小鼠体内产生抗Rg1抗体;利用合成的偶联物成功建立间接ELISA和间接竞争ELISA方法,测得小鼠血清抗体效价在1∶80 000以上,并且所得抗体能特异性结合人参皂苷Rg1.结论 成功合成了人参皂苷Rg1人工免疫原和包被原,可用于下一步的人参皂苷Rg1单克隆抗体制备及建立相应免疫分析方法.
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绿原酸人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
目的 合成绿原酸(chlorogenic acid,CHA)人工抗原,制备CHA多克隆抗体,为制备过敏成分分析的免疫芯片奠定基础.方法 采用碳二亚胺法分别合成CHA免疫抗原(CHA-牛血清白蛋白)和包被抗原(CHA-卵清蛋白);UV法和TLC法鉴定人工抗原偶联是否成功;间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价;间接竞争ELISA方法检测抗体特异性.结果 经UV法和TLC法检测,CHA与BSA偶联成功.血清抗体效价为1:128 000,CHA-PAbs的质量浓度与抑制率的线性方程为Y=-0.10 lnX+ 1.158,线性检测范围为15.6～250 ng/mL,R2=0.995,并且和甘草酸、黄芩苷等与其常配伍应用的中药化合物均无交叉反应.结论 成功制备了灵敏度高、特应性好的CHA多克隆抗体,为CHA的微量检测和过敏性研究提供了实验依据.
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紫铆素人工抗原的合成与鉴定
目的 人工合成紫铆素(butin)的完全抗原并进行鉴定.方法 采用氯乙酸钠(SMCA)与紫铆素中的羟基反应形成羧甲基醚衍生物(紫铆素-SMCA),再通过羧基与载体蛋白(BSA、OVA)偶联形成完全抗原,以TLC法鉴别是否偶联产生新的大分子化合物,并以紫外扫描分析完全抗原的偶联比率,将得到的免疫原紫铆素-BSA按免疫程序免疫Balb/c小鼠.结果 TLC显示已经形成新的大分子化合物;紫外扫描法测定紫铆素-BSA的偶联比为6∶1,紫铆素-OVA的偶联比为5∶1.采用间接酶联免疫测定,产生的抗血清的稀释度可以达到1∶4 000.结论 经过TLC法、紫外扫描法和免疫方法鉴定,成功合成了紫铆素人工抗原.
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马钱苷人工抗原的合成、鉴定及免疫原性的初步研究
目的 首次合成并鉴定马钱苷(loganin)人工抗原,为进一步制备马钱苷单克隆抗体,建立相关免疫分析方法奠定基础.方法 采用高碘酸钠氧化法合成马钱苷免疫原(loganin-BSA)和包被原(loganin-OVA);应用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法鉴定马钱苷人工抗原是否偶联成功;通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测免疫小鼠血清中抗马钱苷抗体效价及其特异性.结果 经MALDI-TOF-MS检测,马钱苷与BSA偶联成功.竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与马钱苷产生特异性结合,血清抗体效价在1:40 000.结论 成功合成了马钱苷人工抗原,为马钱苷单克隆抗体的制备及其在中药质量评价和动物体内药动学方面的应用奠定了基础.
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猪去氧胆酸人工抗原的合成及鉴定
目的 合成并鉴定猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)人工抗原,为进一步制备其特异性抗体,建立相应的免疫分析方法,并为其应用到药理药效的研究中奠定基础.方法 采用混合酸酐法合成HDCA人工抗原(HDCA-牛血清白蛋白),包被原(HDCA-鸡卵清白蛋白);应用硅胶薄层色谱法鉴定人工抗原、包被原合成是否成功;应用人工抗原与弗氏佐剂的乳化液背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠4次后,尾尖取血,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定免疫小鼠抗血清的效价和特异性.结果 薄层色谱法检测结果表明,HDCA与牛血清白蛋白(BSA)偶联成功;小鼠抗血清效价大于1∶8 000,竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与HDCA产生特异性结合.抗血清和甘草酸、黄芩苷、栀子苷等与其常配伍应用的中药化合物均无交叉反应,但与胆酸交叉反应率为90％.结论 成功合成了HDCA-BSA,并可诱发小鼠产生相应特异性抗体.为进一步制备抗HDCA单克隆抗体及HDCA药理作用靶点的研究奠定了基础.
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羟基红花黄色素A人工抗原的制备
目的 研究羟基红花黄色素A(HSYA)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)的偶联方法,获得具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原.方法 通过偶联物透析液的颜色变化、紫外图谱、红外扫描图谱及动物免疫试验来鉴定制备的人工抗原.结果 HSYA-BSA人工抗原在紫外扫描中表现出HSYA和BSA的特征吸收峰;在红外扫描中HSYA-BSA具有HSYA特征官能团的吸收峰和氨基酸的特征吸收峰;间接ELISA检测结果显示产生抗HSYA的特异性抗体,血清效价可达1 : 3 200;标准曲线方程计算得BSA和HSYA的结合率是1:50.结论 通过直接偶联法成功制备出具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原.
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中药活性小分子人工抗原合成的技术要点
中药免疫分析技术适用于中药复杂组分的研究,基于此技术的研究思路与方法越来越引起研究者的重视.免疫分析的前提是抗体制备,中药活性小分子人工抗原的合成是中药活性成分抗体制备的关键步骤.从载体的选择、交联方法的选择、纯化及鉴定方法、合成条件的优化及影响免疫原性的因素等方面,对中药活性小分子人工抗原合成的技术要点进行综述,从而为中药免疫分析技术的建立和发展奠定基础.
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桔梗皂苷D人工抗原的合成及鉴定
目的:合成桔梗皂苷D(PlatycodinD,PD)的人工完全抗原,为制备桔梗皂苷D的单克隆抗体及建立相应的免疫学分析方法奠定基础.方法:采用高碘酸钠(NaIO4)氧化法分别合成桔梗皂苷D免疫抗原(PD-BSA)和包被抗原(PD-OVA).用薄层色谱法鉴定人工抗原是否偶联成功;用动物免疫法测定其抗原性;并融合后筛选阳性孔.结果:薄层色谱法显示PD与BSA/OVA偶联成功;用合成的PD-BSA免疫小鼠后可使小鼠体内产生抗PD抗体,效价在1∶8000以上;融合可得出阳性孔.结论:成功合成了PD人工免疫原和包被原,可用于下一步PD单克隆抗体的制备及建立相应免疫学分析方法.
