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中药小分子化合物人工抗原的制备及鉴定
免疫学分析技术突破了常规的仪器分析方法在检测中药小分子化合物中的局限,近年来已被逐渐应用于中药的质量评价研究中.制备具有良好免疫原性的人工抗原是建立免疫学分析方法用于中药活性成分定性定量检测的首要前提和关键所在.该文主要介绍了中药小分子半抗原的设计思路；载体蛋白的选择；不同结构类型的中药小分子化合物半抗原和载体蛋白偶联的方法及原理；并阐述了半抗原和载体蛋白偶联物的鉴定及偶联率的测定方法.
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石杉碱甲多克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立
目的 制备珍稀药源植物蛇足石杉的活性成分石杉碱甲(huperzine A,HupA)的人工抗原及多克隆抗体,建立快速检测HupA的酶联免疫分析方法.方法 采用戊二醛法,将半抗原HupA与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备人工抗原HupA-BSA和包被抗原HupA-OVA.用HupA-BSA免疫新西兰大白兔,制备抗HupA的抗血清,通过间接ELISA法和竞争ELISA法检测抗血清的效价和特异性.采用Protein A亲和层析法对抗血清进行纯化,以纯化后的多克隆抗体建立HupA的标准竞争抑制曲线.结果 合成的人工抗原HupA-BSA的偶联比为10.8∶1,免疫兔子得到抗HupA的抗血清,其效价为1∶64000,HupA的标准竞争抑制曲线为Y=0.215 1X-0.095 5(R2=0.987 3).结论 成功合成石杉碱甲人工抗原,经过免疫兔子制备抗石杉碱甲的多克隆抗体,建立HupA的酶联免疫检测方法.
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中药莪术中抗肿瘤成分莪术醇人工抗原的合成与鉴定
目的 合成莪术醇全抗原并加以鉴定.方法 先用莪术醇与琥珀酸酐为原料,以三氯甲烷为溶剂,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作催化剂,反应合成半抗原莪术醇琥珀酸单酯,然后,用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺法将莪术醇琥珀酸单酯偶联到牛血清白蛋白,合成了莪术醇的人工抗原,并用激光解析飞行质谱(MALDI-TOF-MS)进行了鉴定,利用质谱特征求得了偶联物中莪术醇与牛血清白蛋白的量,计算出结合比.结果 成功地合成了莪术醇人工抗原,其结合比为19.6.结论 用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺偶联法可合成莪术醇的完全抗原.
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龙胆苦苷人工抗原的合成与鉴定
目的 为建立龙胆苦苷免疫检测方法,需合成龙胆苦苷(GTP)的免疫抗原和包被抗原.方法 将琥珀酸酐与龙胆苦苷中的羟基进行反应,再利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)偶联形成龙胆苦苷-载体蛋白人工抗原,进而利用紫外分光光度计法(UV)、红外光谱法(IR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工抗原,结合三硝基苯磺酸法(TNBS)测定人工抗原的偶联比率,并免疫小鼠,后用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价.结果 IR、UV和SDS-PAGE法检测结果均表明龙胆苦苷与载体蛋白偶联成功,TNBS结果表明GTP-BSA(免疫抗原)和GTP-OVA(包被抗原)偶联比分别为9∶1和6∶1,间接ELISA结果表明免疫小鼠血清中抗龙胆苦苷抗体效价均达到1∶12800以上.结论 本实验成功合成并鉴定了龙胆苦苷人工抗原,为龙胆苦苷免疫分析提供了实践基础.
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雌酮人工抗原的制备与鉴定
目的 制备雌酮人工抗原.方法 采用碳化二亚胺法将雌酮半抗原与载体蛋白牛血清清蛋白连接制备免疫耦联物,用紫外分光光度法测定耦联率,并测定兔抗体血清效价.结果 测得耦联率比为12:1,血清抗体效价为6.4×103.结论 该方法简便、结果准确可靠,可应用于雌酮免疫原合成.
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兼具酶催化活性的布洛芬人工抗原的制备与应用初探
目的:制备以辣根过氧化物酶为载体蛋白的布洛芬人工抗原,并快速测定其偶联比、酶催化活性,进而应用于尿液中布洛芬的检测.方法:利用活化酯法将布洛芬与载体蛋白辣根过氧化物酶偶联,制备布洛芬的人工抗原,采用生物质谱法完成人工抗原偶联比的测定,并对酶催化活性进行了验证.结果:布洛芬人工抗原偶联比为5,辣根过氧化物酶的催化活性未受到任何影响,可以应用于尿液中布洛芬的检测.结论:以酶作为载体蛋白的人工抗原兼具免疫原和酶催化的双重性质,为免疫分析提供了一种新的简单可行方法.
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地高辛人工抗原的合成、鉴定与免疫效价的测定
目的:制备地高辛(digoxin,Dig)的人工抗原及抗血清.方法:采用高碘酸钠氧化法将半抗原Dig分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)反应偶联,制得Dig-BSA人工抗原和Dig-OVA包被抗原后,通过紫外光谱(UV)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定该人工抗原并测定其中结合的半抗原数目；以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,以Dig-OVA作包被抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体效价.结果:合成的人工抗原Dig BSA中Dig与BSA的结合比约为5:1；免疫小鼠得到特异针对Dig的抗血清,Dig抗体的效价达到了1:62 500.结论:成功地合成了Dig人工抗原,且该抗原免疫原性良好.
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银杏内酯B人工抗原及多克隆抗体的制备
目的:制备银杏内酯B的人工抗原与多克隆抗体.方法:以碳化二胺法合成银杏内酯B的人工抗原后,分别以完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂免疫♀BALB/C小鼠.其共免疫4次.结果:制备成功抗银杏内酯B多克隆抗体.结论:该多克隆抗体,效价达到25 600,竞争抑制率达78%,是一个效价高,特异性高的理想抗体.
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食品中违法添加奥沙普嗪的荧光免疫层析方法研究
目的 建立一种筛查食品中违法添加的奥沙普嗪荧光微球免疫层析法(FICA).方法 以改良活泼酯法将奥沙普嗪连接到牛血白蛋白和卵清白蛋白,合成免疫抗原和检测抗原,免疫家兔获得针对抗奥沙普嗪抗体;以抗体标记的荧光微球(40 nm),在检测线和质控线发生免疫反应,分别形成荧光检测信号,构建荧光免疫层析方法.结果 在ELISA体系检测奥沙普嗪的IC50值为13.2 ng·mL 1,与8种相关药物交叉反应率都小于0.1％,优化FICA试剂条对奥沙普嗪的低检测限为2.0 ng·mL-1.优化的FICA试剂对50个市售样品的检测结果,与HPLC验证结果吻合.结论 本方法灵敏、特异、简便、快速,是筛查食品中违法添加奥沙普嗪的有效工具.
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保健食品中违法添加双氯芬酸钠免疫层析筛查方法的建立
目的 为了筛查食品中违法添加的双氯芬酸钠,本研究建立相关胶体金免疫层析检测方法(ICA).方法 以活泼酯机制将双氯芬酸钠连接到不同蛋白质载体,分别合成免疫抗原和检测抗原,免疫家兔获得针对双氯芬酸钠的特异性抗体;抗体标记的胶体金(40 nm)包被在胶体金垫,检测抗原和二抗喷涂在硝酸纤维素膜(NC膜)上,分别构建检测线(T线)和质控线(C线).组装胶金垫、NC膜、样品垫和吸水垫,组成ICA试剂条.结果 在ELISA体系检测双氯芬酸钠的IC50值为9.3 ng·mL-1,与8种相关药物交叉反应率都小于0.01％,以ICA试剂条对双氯芬酸钠的低检测限为2.0 ng·mL-1.IAC试剂对60个市售样品的检测结果,HPLC验证完全吻合.结论 本方法简便、价廉、灵敏、特异,适用于筛查食品中违法添加的双氯芬酸钠.
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重氮化法合成磺胺间甲嘧啶免疫抗原的研究
采用重氮化法将磺胺间甲嘧啶(SM1)与牛血清蛋白(BSA)偶联制备合成抗原BSA-SM1作免疫抗原;用紫外扫描法和聚丙烯酰胺电泳法对其进行鉴定,并测得偶联的结合比.通过紫外扫描和聚丙烯酰胺电泳法的测定证明偶联成功,偶联的结合比为9∶ 1.用BSA-SDM免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗上清(pAb)效价,结果表明,获得了高效价的pAb,为SM1残留免疫学检测方法的建立奠定了基础.
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芒果苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定
目的:合成芒果苷人工抗原并进行免疫原性鉴定.方法:采用经典高碘酸钠法,将芒果苷(mangiferin,MRn)分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)相耦联合成MRn的人工抗原和包被原.用紫外扫描的方法测定其耦联比,并免疫动物,通过间接ELISA方法测定芒果苷抗体的效价,采用间接竞争ELISA(icELISA)法鉴定芒果苷人工抗原(MRn-BSA)的免疫原性.结果:MRn-BSA的耦联比为6∶1,icELISA实验结果表明,4只人工抗原MRn-BSA免疫的小鼠均有特异性抗体产生,抗体效价:1∶4000以上,线性检测范围为1～100 μg/mL.结论:该方法成功合成了MRn的人工抗原,并且在免疫小鼠的血清中产生了针对MRn的抗体,为下一步芒果苷的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立奠定基础.
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肺弹性蛋白降解肽段人工抗原的合成与鉴定?
目的：制备和鉴定肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,为进一步研制慢性阻塞性肺疾病(COPD)免疫检测试剂盒打下良好基础。方法以 Sulfo-SMCC 为偶联剂,钥孔血蓝蛋白(KLH)为载体蛋白制备免疫原；经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)电泳鉴定偶联情况；以免疫原免疫 Balb/c 小鼠制备特异性抗体,间接竞争酶联免疫吸附实验(ELISA)法评价抗血清效价及特异性。结果紫外扫描和 SDS-PAGE 电泳确认了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原合成成功,其蛋白浓度为1.181 mg/mL,抗血清效价高于1∶64000,IC50为13.7 ng/mL,抗血清与无关肽段无交叉反应。结论本实验成功制备了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,其具有较好的免疫原性,为建立快速准确检测 COPD 免疫检测方法奠定基础。
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杀虫剂残杀威人工抗原的制备及免疫效价检测
[目的]制备杀虫剂残杀威(propoxur)人工抗原以及免疫效价的检测.[方法]将杀虫剂残杀威,通过戊二醛法与载体鸡卵清蛋白OVA相偶联,所得的半抗原偶联物为免疫原,用紫外光谱、红外光谱扫描分析所制备的人工抗原,然后免疫小鼠检测效价.[结果]将制备的抗原免疫BALB/e小鼠,免疫后采血测其效价,即通过酶联免疫法(ELISA)检测免疫小鼠所产生的抗体,检测结果为阳性.[结论]小鼠产生独特型抗体.
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罗汉果甜苷V人工抗原免疫原性检测法的建立与评价
目的 制备罗汉果甜苷V(mogroside V,MogV)-载体蛋白复合物人工抗原及抗血清,建立抗血清与MogV特异性反应的检测方法,为进一步制备MogV的单克隆抗体、建立快速检测MogV的ELISA法提供技术基础.方法 将MogV与丁二酸酐、载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,通过紫外扫描光谱计算出结合的半抗原数目;以此抗原免疫Balb/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测效价和特异性.结果 合成的人工抗原MogV-HS-BSA结合比约为44:1,MogV-HS-HAS结合比约为64:1;通过免疫小鼠得到特异性针对MogV的抗血清,血清效价较高.结论MogV人工抗原有较好的免疫原性,建立的免疫原性检测方法简便可行.
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河豚毒素的新型人工抗原及其高效的抗毒效应
目的河豚毒素(TTX)是高毒神经性毒素,目前无特效解毒药.为探索免疫防治河豚毒素中毒的可能性而开展本研究.方法以中国鲎血蓝蛋白(TTH)为载体,通过甲醛将河豚毒素与载体蛋白偶联制成人工抗原(TTX-TrH)并免疫Balb/c小鼠.结果免疫小鼠经TTX攻毒,单次ip2×LD全活;3×LD可存活97%;半数动物可耐受l2×LD以上攻毒;约32%动物可耐受18×LD以上剂量;少数动物可耐受22～26个LD而存活.免疫鼠能耐受多次反复攻毒,高耐受累积剂量达100×LD以上.描述了机体对TTX半抗原的抗体反应规律.结论研制的TTX的实验疫苗可高效预防TTX的攻毒,免疫防治是对抗河豚毒素中毒很有希望的途径.
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甲胺磷人工抗原的合成和鉴定
目的合成和鉴定甲胺磷人工抗原.方法用磷酸化方法偶联氧、硫二甲基硫代磷酰氯到牛血清蛋白上,然后做一系列的实验,如:测定磷、紫外、31P核磁共振光谱和免疫小鼠等.结果人工抗原的偶联比是16,人工抗原的紫外光谱图与牛血清蛋白质相比发生改变,人工抗原和标准甲胺磷的31P核磁共振光谱具有相同的化学位移峰,被免疫的小鼠产生了抗甲胺磷的抗体.结论甲胺磷人工抗原合成成功,为其免疫测定方法的建立提供了条件.
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甲氰菊酯人工抗原的合成和鉴定
目的 合成与鉴定甲氰菊酯的人工抗原.方法 通过水解、酰化、酯化等反应合成了甲氰菊酯的半抗原2,2,3,3.四甲基环丙烷羧酸-a-(N-丁酸基)-甲酰氨-3-苯氧基苄酯(Ⅳ)和2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸-a-羧基-3-苯氧基苄酯(Ⅲ).通过碳二亚胺法将半抗原Ⅳ与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原,通过混合酸酐法将半抗原Ⅲ与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被抗原.结果 用质谱和核磁共振对Ⅲ和Ⅳ进行结构表征,合成产物为目标物.紫外光谱法鉴定结果表明,免疫抗原和包被抗原都发生了有效偶联,偶联比38:1和15:1,免疫抗原通过免疫新西兰大白兔得到的抗体效价为5.12×105.结论成功的合成了甲氰菊酯的人工抗原,为其免疫方法的建立奠定了基础.
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甲基对氧磷人工抗原的合成及鉴定
目的 合成甲基对氧磷（M1600）人工抗原。方法 用醋酸-锌粉盐酸还原对氧磷，制备氨基甲基对氧磷，重氮化法使氨基甲基对氧磷与牛血清白蛋白（BSA）及中国鲎血蓝蛋白（TTH）偶合，合成人工抗原M1600-BSA、M1600-TTH。结果 M1600-BSA免疫新西兰兔10周后，双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测，证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清。结论 成功地合成了甲基对氧磷人工抗原，为其免疫分析方法的建立提供了条件。
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3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮-丁二酸酯人工抗原的合成
目的 合成3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮-丁二酸酯(5-烯雄甾酯)人工抗原.方法 以N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为催化剂,采用活性酯法将5-烯雄甾酯与牛血清白蛋白偶联.结果 产物经元素分析、质谱和红外光谱确定,合成得到每个BSA载体连接6个半抗原小分子的人工抗原.结论 采用琥珀酸酐衍生化5-烯雄甾酯,活性酯法合成抗原,产率高、副产物少.
关键词： 3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮-丁二酸酯 人工抗原 活性酯 牛血清白蛋白 合成
