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不同加工条件下转基因大米潮霉素标记基因(hpt)稳定性研究
目的从DNA稳定性的角度,探讨转基因大米潮霉素标记基因hpt向食品或消化道微生物转移发生水平转移的可能性.方法利用针对hpt不同大小片段的PCR扩增体系,对hpt在转基因大米加工食品中的稳定性进行研究.结果建立的PCR体系能稳定扩增出hpt236bp-910bp不同大小的5个片段.利用这一PCR体系对s86转基因大米不同加工食品的检测显示,加工米饭、粥大于500bp的片段已降解,爆米花和锅巴大于236bp的hpt片段已降解.对照M86大米加工米饭和粥仅能扩出植物叶绿体基因rbcl片段,爆米花、锅巴及空白对照所有扩增均为阴性.结论hpt在转基因大米加工食品中均已不同程度的发生了降解,不同加工方式对hpt片段降解影响显著,在加工后hpt以较大或完整片段向食品或消化道微生物转移的可能性减小.
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单细胞凝胶电泳技术研究兔牙髓细胞核DNA降解的时间效应
目的 研究DNA降解变化与死亡时间关系,探讨兔死后牙髓细胞核DNA的降解机理及寻找灵敏、实用的DNA降解监测指标,为死亡时间的法医学研究提供一种新的方法和技术.方法 利用快速、灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳(SCG)技术结合荧光显微镜和专业的计算机图像分析技术,以“彗星样”细胞出现率(计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例)、头半径、尾长度、头/尾DNA含量比例、Oliver矩、尾矩、头面积和尾面积来评价死后兔牙髓细胞核DNA的降解程度.结果 在个体死亡72h内,测定的8项参数指标中尾DNA含量比例、彗星尾长、尾矩、Olive矩、尾面积都呈增加趋势,头半径,头DNA含量比例,头面积均呈下降趋势.上述参数均与死亡时间具有高度的相关性.并将每个参数的测量值进行了多项式运算,获得了更能体现DNA降解趋势的二项式回归方程(P＜0.001),具有显著的统计学意义.结论 应用单细胞凝胶电泳技术,监测机体死后牙髓细胞核DNA降解变化,将会成为推断死亡时间精确、客观的新方法.
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脱氧核糖核酸酶Ⅰ在急性冠状动脉综合征诊断中的应用
目前有大量的研究表明急性冠状动脉综合征(acute cor-onary syndrome,ACS)与炎症反应及粥样斑块的不稳定破裂有密切关系,而细胞凋亡在其中亦起着重要作用,脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)是细胞凋亡中双链DNA降解过程中起着重要作用的核酸酶,可能直接参与了ACS的发生和发展过程.
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不同温度下人脾细胞DNA降解推断早期死亡时间
目的 对不同温度下人体脾细胞DNA降解状态进行多参数联合定量分析,得出温度相关的多元回归方程.方法 选取13例已知PMI的人体离体脾脏,在死后13h～34h内,分别在10℃、20℃及30℃条件下,每隔1h取材,进行细胞学涂片,Feulgen-Vans染色,选用图像分析系统检测几何参数(ID)及灰度参数(AOD、IOD、AG、LDC)指标,对不同温度的检测指标进行多元回归等统计分析,得出相应的回归方程.结果 温度相关的脾细胞DNA降解推断死亡时间回归方程是:Y=-0.668619XT+2.31609XID-33.45671XAOD-1.13296XIOD+0.44433XAG(XT=10,20,30).结论 不同温度的牌细胞AOD、IOD、ID、AG均有显著性差异,温度及反映DNA含量的各个参数与PMI存在很强的相关性,可以将温度作为参数引入方程用于推断PMI.
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死后小鼠肾组织细胞核DNA变化规律的研究
目的:研究DNA降解变化与死亡时间的关系,为法医学推断死亡时间提供一种比较准确可靠的新方法.方法:应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术结合荧光显微镜和专业的计算机图像分析技术,测定111只小鼠在死后72 h内不同时间点小鼠肾组织细胞核头半径、尾长度、头DNA含量比例、尾DNA含量比例、尾矩、Olive矩、头面积、尾面积8项参数的变化值.结果:在个体死亡72 h内,测定的8项参数指标中尾DNA含量比例、彗星尾长、尾矩、Olive矩、尾面积都呈增加趋势,头半径、头DNA含量比例、头面积均呈下降趋势.上述参数均与死亡时间具有高度的相关性.并将每个参数的测量值进行了多项式运算,获得了更能体现DNA降解趋势的二项式回归方程和多元回归方程,均具有高度的统计学意义(P均＜0.01).结论:应用本研究提供的72 h内肾组织组织DNA变化与死亡时间之间呈线性关系的各组回归方程,为法医学推断死后经过时间提供了一种新的、客观的、精确的方法和参考依据.
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创伤弧菌经细胞Toll样受体2、4途径导致树突状细胞急性坏死的研究
目的 探索创伤弧菌(Vv)感染树突状细胞(DC),经Toll样受体(TLR)2、4途径致DC急性坏死的实验研究.方法 建立Vv1.1758株与DC 2.4混合培养感染模型,用光学显微镜观察细胞感染率,电子显微镜观察Vv定位与细胞结构变化,实时定量反转录PCR测定TLR2、4mRNA表达量,ELISA法检测TNF-α表达量,DNA梯度电泳定性检测细胞凋亡,流式细胞术定量检测细胞凋亡及坏死率.率的比较采用x2检验,多组间数据比较采用方差分析.结果 混合培养0.5、1、2、4、6h时的细胞感染率分别为(7.8±0.8)％、(13.9±1.1)％、(34.6±4.9)％、(77.8±10.2)％和(95.8±13.1)％,混合培养2h后的感染率与培养0.5h相比差异有统计学意义(均P＜0.05).细菌定位于DC2.4细胞内侧,2h核染色质明显活跃,核内出现凋亡小体；4h胞质内出现空泡,染色质聚集,胞膜毁损严重；6h线粒体高度肿胀变形,细胞坏死.TLR2、4 mRNA表达于0.5h已达峰值.TNF-α在1h时开始增高(P＜0.05),2h达峰值.DNA梯度电泳2h呈冲刷状坏死,4～5 h出现720 bp与900 bp凋亡带.2、4、6h时细胞早期凋亡率分别为(3.1±3.8)％、(7.8±4.7)％和(12.7±8.2)％,显著高于对照组的(0.5±0.7)％(均P＜0.05).细胞坏死率分别为(16.7±12.5) ％、(41.6±25.9)％和(75.5±33.6)％,显著高于对照组的(2.3±0.8)％(均P＜0.05).结论 Vv感染DC可通过TLR2、4表达上调,TNF-α增加导致DNA降解,期间以细胞凋亡与坏死同时并存,但以坏死方式降解为主.
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多吡啶钌配合物[（Phen）2 Ru（dppz）]（PF6）2的抗菌活性及机制研究
目的：研究多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)]( PF6)2的抗菌活性，并进一步探讨其作用机制。方法采用小抑菌浓度( MIC)以及小杀菌浓度( MBC)，测定无机配合物[( Phen)2 Ru( dppz)]( PF6)2的抗菌活性。为了阐明其抗菌机制，首先利用配合物自身荧光特性和核酸染料对DNA的竞争性结合所导致的荧光强度变化，以确定配合物与DNA的结合能力；然后通过DNA凝胶电泳，检测配合物与细菌基因组DNA结合后产生的效果以检测抗菌活性的机制。结果多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性，小抑菌浓度达0．2~0．4 g·L-1。荧光检测显示，配合物能够与细菌DNA发生结合，以此为基础，配合物能够干扰细菌的转录过程，抑制细菌生长。结论本研究证明了多吡啶钌配合物[( Phen)2 Ru( dppz)]( PF6)2的抗菌活性及作用机制，为其进一步开发奠定了基础。
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阿胶加工工艺过程中DNA降解规律研究
目的：本文以阿胶传统工艺加工过程样品为研究对象，探讨关键加工阶段阿胶样品中驴基因组DNA核基因和线粒体基因的降解变化规律。方法提取阿胶工艺过程中的驴基因组DNA，分别利用超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、普通PCR、荧光定量PCR和简单序列重复（ SSR）微卫星毛细管电泳（ CE）检测方法对提取的DNA质量进行评价。结果研究结果显示，在原料驴皮、化皮、双效、浓缩和加辅料阶段，琼脂糖凝胶电泳均能检测到清晰的条带，普通PCR可扩增到200~1600 bp左右的片段，而在凝胶阶段DNA降解为严重，只能利用琼脂糖凝胶电泳检测到100~800 bp的目的片段，利用荧光定量PCR检测技术线粒体基因在阿胶加工各个阶段均可检测出，核基因凝胶阶段未检出；通过PCR-SSR-CE检测在凝胶阶段核基因未检出特征峰，更进一步证明了凝胶阶段DNA核基因降解严重。结论对阿胶工艺加工过程DNA变化规律发现，随着阿胶加工的深入进行，各个阶段DNA发生不同程度的降解，其中凝胶成品阶段降解为严重，本研究对比普通PCR、荧光定量PCR和简单序列重复微卫星毛细管电泳检测方法，发现荧光定量PCR检测方法快速、灵敏和可靠，通过比较发现以线粒体基因为靶基因在阿胶的各个加工阶段均能满足DNA溯源的要求。
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应用单细胞凝胶电泳检测大鼠死后脾细胞核DNA降解与死亡时间的关系
目的:探讨应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测大鼠死后脾细胞核DNA降解与死亡时间的一般规律,为早期死亡时间的推断提供新的方法.方法:建立大鼠死亡模型,在死后27 h内,每隔3 h取脾组织样本进行单细胞凝胶电泳,用共聚焦显微镜摄取彗星图像,应用彗星图像分析软件(IMI1.0)进行图像分析,并作统计学分析.结果 :大鼠死后,脾细胞在电泳图像上出现了明显的彗星形拖尾,其尾长(TL)、尾矩(TM)在一定的时间范围内(0～15 h)随死亡时间的延长而逐渐增大,二者均与死亡时间(PMI)呈现一定的相关回归关系.结果:单细胞凝胶电泳技术可应用于早期死亡时间的推断;彗星图像分析软件为SCGE的结果分析提供了便利.
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彗星试验检测大鼠牙髓细胞DNA降解推断死亡时间的研究
目的在特定条件下,用彗星试验技术,动态观察SD大鼠死后6～36 h牙髓细胞DNA降解规律,探讨推断死亡时间的一种方法.方法模拟广州地区近5年秋季10月份的平均气温25.1℃,建立SD大鼠死亡模型.分别于死后6、12、24、36、48 h提取大鼠牙髓组织进行彗星试验,荧光显微成像系统采集图像,同时获取多个分析参数(Comet4.0),并进行统计学处理.结果在死后6～36 h,SD大鼠牙髓细胞DNA的碎片随着死后间隔时间的延长而增加;尾长在死后各时间点依次呈明显的上升趋势;Oliver尾矩和尾DNA随着死亡时间的延长,也均有一定的上升趋势.结论本研究提示细胞DNA的降解随着死后间隔时间的延长而增加;尾长随着死后间隔时间的延长在各时间点呈明显的上升趋势,用于推断死亡时间优于Oliver尾矩和尾DNA.
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彗星试验检测大鼠死后肾脏细胞DNA含量与死亡时间的关系
[目的] 探讨特定条件下,利用彗星试验测定SD大鼠死后6 ～ 48 h肾脏细胞DNA含量与死亡时间的关系.[方法] 健康成年雌性SD大鼠,按取材时间随机分为6组,每组3只.颈椎脱臼法处死动物,置于25.1 ℃(广州地区近5年10月份平均气温)培养箱中,分别于0、6、12、24、36、48、60 h取大鼠肾脏组织,制备单细胞悬液,进行彗星试验,荧光显微成像系统采集图像,采集相关参数(Comet 4.0)并进行Kruskal-Wallis检验. [结果] 死后6 ～ 48 h,SD大鼠肾脏细胞DNA碎片随死亡时间延长而增加,尾长在死后各时间点依次呈明显的增长趋势,Oliver尾矩和尾DNA随死亡时间的延长,亦有一定的增长趋势,60 h未能测出.Kruskal-Wallis检验显示:各时间点彗星尾长均数的差异有高度显著性(P＜0.01);彗星尾矩均数在死后6 h和12 h差异无统计学意义(P＞0.05),24 h和36 h彗星尾矩均数差异有显著性(P＜0.05);尾DNA均数在6 h,12 h,24 h三个时间点差异无显著性(P＞0.05),但与36 h,48 h尾DNA均数的差异均有显著性(P＜0.05).[结论] SD大鼠肾脏细胞DNA降解随死亡时间延长而增加,彗星试验技术为死亡时间推断提供了重要的实验依据.
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大鼠死后细胞DNA的降解变化与死亡时间的关系
目的 研究尸体组织细胞DNA降解的死后变化规律,探讨其在法医学死亡时间推断的应用价值和前景.方法 采用流式细胞仪DNA定量技术,检测在温度22.8℃、相对湿度80％的实验条件下和冰箱-20℃的冷冻条件下,大鼠死后即刻(0 h)至死后96 h肝、脾、肾组织DNA的降解情况.结果 在温度22.8℃、相对湿度80％的实验条件下,随着死亡时间的延长,含有降解DNA片段的细胞数目逐渐增多,与死亡时间有显著的相关性,死后各组织细胞DNA降解速率并非相同,肾组织的降解速率较肝、脾组织慢.而在冰箱-20℃的冷冻条件下,大鼠组织DNA在死后几乎不发生降解.结论 在温度22.8℃、相对湿度80％的实验条件下,尸体组织细胞DNA的降解与死亡时间有显著的相关性,可望成为法医学死亡时间推断的新手段.而-20℃可以作为保存检材的理想条件.
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死后5～36 h人脑细胞DNA降解含量的图像分析
目的通过对死后5～36 h脑细胞降解后残存DNA含量的定量分析来推断其早期死亡时间.方法选取32例已知死亡时间的人体脑组织,在死后5～36 h内每小时进行细胞学涂片、Feulgen-Vans染色,采用图像分析技术检测反映脑细胞核DNA含量的平均光密度、积分光密度、平均灰度等灰度参数,分析脑细胞残存DNA的含量与其对应的死亡时间的变化规律.结果在5～36 h内平均光密度、积分光密度随死亡时间的延长而逐渐减小、平均灰度逐渐增大,且其均值均与死亡时间显著性相关,并得出对应的回归方程.结论反映人脑细胞DNA含量改变的灰度参数均与死亡时间有明显的相关性,是推断早期人体死亡时间的有效的定量指标.
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细胞凋亡的研究进展
细胞凋亡是近年来生物学及医学研究的一个热点.凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型,它还具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制.
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人体死后肝细胞DNA含量与死亡时间关系的研究
目的 研究人体死后肝脏细胞DNA含量变化与死亡时间的关系及影响因素.方法 选取46例已知死亡时间的人体肝脏,根据离体肝脏所处的环境温度分为12～19℃(A组)和20～27℃(B组)两组,每组23例.在死后24～72h内每隔4h穿刺取肝组织1次,制成细胞悬液,经RNA酶消化,PI染色后,用流式细胞仪测定被检测细胞中含不完整DNA的细胞数所占百分比,所得数据经Expo32 V1.2软件计算N值.结果 死后24～72h肝细胞N平均值,A组从10.91%增至49.72%,B组从16.22%增至69.63%.两组N平均值随死亡时间的延长均逐渐增高,与死亡时间有相关性,A组r值为:0.598,B组r值为0.77357.并且建立了不同环境温度对应的同归方程.结论 在不同环境温度下,死后24～72h内人体肝脏细胞DNA降解均随死亡时间的延长和环境温度的升高而逐渐加快,相关数据可望为死亡时间推断提供一定参考依据.
关键词： 法医病理学 死亡时间(PMI) DNA降解 肝细胞 流式细胞术(FCM) -
大鼠脑、骨髓细胞核DNA降解推断死后间隔时间的研究
目的 检测大鼠死后不同温度下脑、骨髓细胞核DNA降解规律,寻找推断早期死亡间隔时间(PMI)的新参数.方法 10℃和20℃下,大鼠死后0-40h内,每隔4h取材脑组织和骨髓,单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA降解程度,线性回归分析比较彗星参数HeadDNA%、尾长(TL)、Olive尾矩(TM)与PMI的关系.结果 大鼠死后早期脑细胞、骨髓细胞核HeadDNA%随着PMI逐渐下降的程度不同,20℃脑细胞核HeadDNA%降解速率较快.与骨髓细胞相比,脑细胞核HeadDNA%与PMI线性关系较好.与TL、TM相比,HeadDNA%与PMI的线性关系较好.结论 脑组织是利用SCGE检测DNA降解推断PMI的合适检材.HeadDNA%较TL、TM推断PMI的价值更高.
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彗星试验检测死后DNA降解推断PMI的参数选择研究
目的 筛选出彗星试验检测死后DNA降解推断死亡时间(PMI)的合适彗星参数. 方法 大鼠断颈处死后置于10℃和20℃环境中44h,每4h取材脑和骨髓组织制成细胞悬液进行彗星电泳,CASP软件测量彗星参数,线性回归分析和比较各参数与PMI的相关关系. 结果 死后DNA随PMI的延长逐渐降解,彗星头和尾DNA百分比、尾DNA、Olive尾矩、尾面积、尾矩等参数与PMI呈稳定的线性相关关系.结论 彗星头和尾DNA百分比、尾DNA、Olive尾矩、尾面积、尾矩等参数是彗星试验检测死后DNA降解推断PMI的合适参数.
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单细胞凝胶电泳分析死后小鼠骨骼肌细胞核DNA降解
目的研究小鼠死后骨骼肌细胞核DNA降解与死亡时间的关系.方法应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术结合荧光显微镜和专业的计算机图像分析技术,测定111只小鼠在死后72h内不同时间点骨骼肌细胞核DNA电泳形状的8项参数值,所得数据进行统计学分析.结果在个体死亡72h内,"彗星"的尾DNA含量比例、尾长、尾矩、Olive矩、尾面积数值随时间的延长而增大;而"彗星"的头半径,头DNA含量比例和头面积数值则随时间的延长而减小.经对每个参数的测量值进行多项式运算,获得DNA降解趋势的二项式回归方程(P＜0.001)和多元回归方程(P＜0.0001),且均具有极显著性意义.结论在死后一定时间内,小鼠骨骼肌组织核DNA降解随死后经过时间的变化而呈一定规律性变化,DNA降解与死亡时间之间呈线性相关.
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单细胞凝胶电泳检测大鼠死后肝细胞核DNA降解
目的应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测大鼠死后肝细胞核DNA降解规律,分析与死亡时间的关系,为早期死亡时间的推断提供新的方法.方法在大鼠死后30h内,每隔3h取肝组织样本进行单细胞凝胶电泳,用共聚焦显微镜摄取彗星图像,应用彗星图像分析软件(IMI1.0)进行图像分析,并作统计学分析.结果死后大鼠的肝细胞在电泳图像上出现明显的彗星形拖尾,其尾长(TL)、尾矩(TM)在一定的时间范围内(0～18h)随死亡时间的延长而逐渐增大,二者均与死亡时间(PMI)呈现一定的相关回归关系.结论单细胞凝胶电泳技术可应用于早期死亡时间的推断.
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离体人肝细胞核DNA含量死后变化的图像分析研究
目的应用图像分析技术研究人肝细胞DNA降解与死亡时间的关系.方法选取18例已知死亡时间的人体肝脏,在死后4～36h内每小时进行细胞学涂片、Feulgen-Vans染色,应用图像分析系统研究肝细胞核平均灰度、平均光度、积分光密度等参数在死后的变化规律.结果在4～36h内随死亡时间的延长,肝细胞核的平均灰度逐渐上升,平均光度、积分光密度逐渐下降,获得了36h内3个参数变化的回归方程.结论肝细胞核的平均灰度、平均光度和积分光密度均与死亡时间有明显的相关性,可望用于推断早期人体死亡时间.
