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原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞自分泌转化生长因子β1浓度检测及对转化生长因子β1增殖的调节
背景:体外实验常采用外源性转化生长因子β1 刺激来观察细胞增殖变化,易忽略细胞本身自分泌转化生长因子β1 的影响.目的:检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞(L929) 自分泌转化生长因子β1 的浓度和细胞增殖的变化.方法:Elisa 试剂盒检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞各时相点细胞内和培养上清中生长转化因子β1 水平.结果与结论:纤维肉瘤细胞内转化生长因子β1 浓度随培养时间延长而升高,原代成纤维细胞内转化生长因子β1 浓度随培养时间延长而降低;两种细胞培养上清转化生长因子β1 浓度均随时间而上升,但纤维肉瘤细胞显著高于原代成纤维细胞(P < 0.01),峰值时达到原代成纤维细胞的20 倍;两种细胞增殖曲线在72 h 内均随时间而显著增高(P < 0.01),同一时间点比较,纤维肉瘤细胞明显高于原代成纤维细胞.提示自分泌转化生长因子β1 具有促进细胞增殖的作用,不同的自分泌水平可能是影响原代成纤维细胞这种正常细胞和纤维肉瘤细胞肿瘤细胞对于外源转化生长因子β1 反应不同的重要原因.
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成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案
目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法.方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08％胰酶+0.1％胶原酶Ⅱ消化15min,B:0.2％胶原酶Ⅱ消化15 min,C:0.2％胶原酶Ⅱ消化60min,D:0.2％胶原酶Ⅱ消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞.采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定.结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3d即可传代.72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97％.台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳.结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型.
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人生长激素在原代成纤维细胞中的表达
目的:通过人生长激素基因(hGH)逆转录病毒表达载体的构建,与体外表达为生长激素缺乏症(GHD)基因治疗的进一步体内研究奠定基础.方法:质粒PNMG3用EcoR I酶切,将约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子(mMT-1)和人生长激素(hGH)基因片段克隆至逆转录病毒表达载体pLX-SN中,对阳性重组子pLXSNhGH进行酶切鉴定,脂质体转染包装细胞系PA317,G418筛选抗性克隆,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒,将病毒感染原代小鼠胚胎成纤维细胞,应用RT-PCR、Southern、Western和ELISA对其转染及表达情况进行鉴定.结果:成功构建了人生长激素基因逆转录病毒表达载体pLXSHhGH,在原代小鼠胚胎成纤维细胞可表达生理水平的hGH.体内活性鉴定证明表达蛋白在动物体内是稳定的.结论:人生长激素基因逆转录病毒表达载体pLXSNhGH的成功构建与体外表达,为细胞移植系统引入GHD基因治疗的研究奠定了基础.
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移植血管外膜早期NADPH氧化酶激活和新生血管形成
目的：动脉外膜所产生的活性氧和新生血管形成，可能导致和促进病理性血管重构的形成。本课题研究NADPH氧化酶在同种异体主动脉移植模型的外膜血管动态表达和新生血管形成。方法：将F344大鼠胸主动脉移植到Lewis腹主动脉造模。于移植后0．5、3、7和14 d收集移植血管，进行形态学分析、免疫组化和定量PCR检测。结果：血管外膜移植后3 d、内膜7 d增厚。移植血管外膜NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox蛋白和mRNA表达水平3 d开始升高，14 d达高峰。免疫组化显示，巨噬细胞浸润可能是NADPH氧化酶表达的主要来源。而淋巴细胞浸润在各时点无显著差别。移植血管外膜分离、培养的原代成纤维细胞NADPH氧化酶表达也增加。 siRNA－p47phox沉默p47phox基因后，BrdU掺入和Transwell迁移实验显示，移植血管外膜成纤维细胞的增殖和迁移能力显著受抑制。此外，移植14 d，移植血管外膜增厚伴有新生血管形成明显增加，外膜中微血管密度和血管内膜厚度呈正相关。结论：移植损伤可诱导血管外膜NADPH氧化酶表达和新生血管的形成，移植引起的外膜活性提高可能成为预防、治疗血管病变的靶点。
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用原代培养方法建立炎症性牙龈和牙周膜组织细胞有限细胞系
体外培养方法、培养条件、病例标本来源的特殊性、细胞种类及实验技巧等均影响各自原代细胞培养的成功率,同时也是限制了很多研究的原因之一.虽然已有报道尝试通过克隆杂交、基因转染技术建成体外无限细胞系,但不可避免地含有部分肿瘤样细胞的特性,其结果的参考价值受到影响.临床健康者来源的牙龈和牙周膜成纤维细胞培养方法已有介绍且成功率较高[1～4],但炎性病变时牙龈和牙周组织的表现和反应至今未见专门报道.作者结合有关炎症牙周组织成纤维细胞体外培养实验报道[5～7],将培养牙周炎症组织原代成纤维细胞的方法介绍如下.
