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吉非替尼治疗前后肺腺癌患者血清蛋白质谱的变化
背景与目的 表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治疗晚期NSCLC患者终都会出现耐药.本研究目的 是检测耐药前后血清蛋白质谱的变化,探索可能用于预测TKI治疗后出现耐药的血清预测因子.方法 收集9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼(gefitinib)治疗前后自身配对的血清样本20份,即入组口服吉非替尼前及临床评价为疾病进展前两周所采集的外周血血清.所有的患者对吉非替尼的佳总疗效评价为疾病稳定或部分缓解.所有样本用弱阳离子微珠进行预分离后.在Bruker AutoflTM基质辅助激光解析离子化-时间飞行质谱仪(MALDI-TOF-MS)上进行血清蛋白质谱检测.以ClinProTools(Version:2.1)软件进行数据采集分析.结果 自身配对分析发现有7个血清蛋白质表达水平在肺癌患者耐药前后的血清中有统计学差异.该7个血清蛋白质谱峰为3 242.09、8 690.36、2 952.64、3 224.04、1 450.51、1 887.8及3 935.73(m/z).有3个血清蛋白(3 242.09、2 952.64及3 224.04)在耐药血清中下调,其余4个血清蛋白(8 690.36、1450.51、1 887.8及3 935.73)则出现上调.结论 特定的血清差异蛋白可能与吉非替尼治疗有效患者在治疗过程中出现耐药相关.这些差异蛋白的特性及其与吉非替尼治疗耐药的分子机制有待进一步研究.
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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定及同源性分析中的应用
目的 评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对我院血流感染样本中醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的鉴定及同源性分析中的应用.方法 收集2011年4月-2015年4月我院非重复血流感染标本,对VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪初步鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的菌株,开展基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,用MALDI-Biotyper软件和ERIC-PCR进行同源性分析,并用16S rRNA及recA基因测序技术进行验证.结果 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对20株VITEK 2无法鉴定到种的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌展开了有效的鉴定,其中9株为医院不动杆菌(Acinetobacternosocominalis),11株为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii),两种细菌的质谱图中均含有特异性的峰图,能有效地将两类细菌进行区分.同源性分析结果将菌株分为2大簇(Ⅰ型11株,Ⅱ型9株),Ⅱ型又分为3小簇(Ⅱa4株,Ⅱb3株,Ⅱc2株).Ⅰ型、Ⅱ型分布在我院4个病区.结论 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定方面具有精准、快速的优点,可以鉴别出皮特不动杆菌和医院不动杆菌,MALDI-Biotyper软件进行同源性分析十分便捷.
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小鼠H22肝癌细胞中高表达膜蛋白的初步分析
目的:为了对小鼠H22肝癌细胞中高表达膜蛋白进行初步的分析并探索其与肿瘤细胞恶性行为的相关关系.方法:分别培养并裂解小鼠正常肝细胞及H22肝癌细胞株,采用疏水性裂解液分步提取膜蛋白,双向电泳分离.ImageMaster 2DPlatinum软件对电泳图谱进行对比分析,选择在H22细胞中典型的高表达膜蛋白并采用MALDI-TOF-MS进行鉴定.结果:从H22细胞中提取的膜蛋白约60％表现为高表达.8个典型的在H22细胞中高表达的膜蛋白被鉴定为紧联蛋白ZO -2、HMGCoA还原酶、囊泡蛋白分选相关蛋白52、分选和装配结构组分50、巨噬细胞清道夫受体Ⅰ/Ⅱ型、硫酸酯酶修饰因子2、PKC和CKⅡ底物蛋白3和C9orf135蛋白.结论:H22肝癌细胞中大多数膜蛋白表现为高表达.从已鉴定的膜蛋白推测,H22细胞功能改变可能涉及细胞迁移、膜融合、信号转导、基因表达调控及能量代谢等,这种改变可能与肿瘤细胞的恶性行为相关.
关键词： 膜蛋白 蛋白表达 肝癌细胞 双向电泳 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 -
抗人羧酸酯酶-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备鼠抗人羧酸酯酶-Ⅱ(human carboxylesterases-Ⅱ,hCE-Ⅱ)单克隆抗体(mAb)并对其特性进行鉴定.方法:以含hCE-Ⅱ的人肝脏微粒体蛋白混合抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗hCE-Ⅱ的mAb,并用Protein-G亲和层析法纯化mAb.用间接ELISA法测定mAb的效价,以Western blot鉴定mAb的特异性、免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位.用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF),再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原.结果:获得1株可持续、稳定分泌抗hCE-Ⅱ的mAb的杂交瘤细胞系.杂交瘤细胞分泌的mAb Ig的亚类(型)为IgG1(κ),腹水mAb的效价达1×10-7.Western blot分析显示,在Mr为62000处有1条清晰的带.免疫组化染色显示,该mAb可与肝细胞的浆蛋白结合(hCE-Ⅱ存在于肝细胞浆内微粒体),而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合.该mAb免疫沉淀物的Mr为62000,与hCE-Ⅱ的Mr相符.对免疫沉淀的蛋白质进行质谱鉴定证实,该mAb对应的抗原为hCE-Ⅱ.结论:制备出的鼠抗hCE-Ⅱ的mAb效价高、特异性良好,为进一步研究hCE-Ⅱ的功能及其在肝癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具.
关键词： 人羧酸酯酶-Ⅱ 单克隆抗体 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 -
MALDI-TOF MS在短期培养后胸腹腔积液中细菌快速鉴定的应用
目的 对临床胸腹腔积液样本进行短期培养,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行细菌鉴定,以建立可用于胸腹腔积液的快速细菌检测方法.方法 收集360例细菌感染的胸腹腔积液(胸腔积液163例、腹腔积液1 97例),所有样本分为三份:一份常规培养并使用微生物鉴定仪检测;第二份直接离心集菌后用MALDITOF MS鉴定;第三份与营养肉汤混合并短期培养2h,离心洗涤后用MALDI-TOF MS鉴定.以微生物鉴定仪结果作为金标准,评估MALDI TOF MS对短期培养后胸腹腔积液中致病菌的鉴定效能.结果 MALDI-TOF MS对短期培养后两种样本的正确检出率分别为94.5％和90.9％,总的未检出率只有7.5％;单一细菌生长的样本鉴定结果与常规方法符合率达到94.1％;能从混合细菌生长的样本中准确鉴定优势菌.结论 经过短期培养后的胸腹腔积液样本,MALDI-TOFMS检出率高,结果可靠:所需时间比常规培养缩短至少12h,可为临床准确快速提供病原菌报告.
关键词： 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 短期培养 胸腹腔积液 快速鉴定 -
紫杉醇抗胆管癌细胞差异表达蛋白的分离、质谱鉴定及生物信息学分析
目的:筛选紫杉醇诱导胆管癌细胞凋亡的相关蛋白并鉴定差异表达的蛋白点以寻找抗胆管癌药物作用的新靶点,筛选胆管癌新的肿瘤标志物,为胆管癌的早期诊断、疗效观察提供基础理论依据.方法:应用比较蛋白质组学技术对紫杉醇诱导凋亡的胆管癌QBC939细胞进行蛋白分离和蛋白表达谱差异分析,筛选并鉴定其相关蛋白并测定其胶内酶解后的肽指纹图谱.结果:本研究发现对照组和实验组蛋白点匹配率分别为(90.1±0.14)%和(87.1±0.22)%(P＜0.05),匹配后在干预组中共发现68个差异表达蛋白点,其中47个表达下调和21个上调;共获得28张PMF,初步质谱鉴定发现11个与凋亡相关的差异表达蛋白,其中6种蛋白表达上调,5种蛋白表达下调.结论:应用蛋白质组学技术分析所获得的68个差异蛋白质点可能在QBC939细胞发生凋亡过程中发挥重要作用;被鉴定出的11个与细胞凋亡相关的差异蛋白点提示紫杉醇是通过多个重要蛋白,发挥其诱导细胞凋亡的抗癌作用机制的.
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蛋白组学研究中胰腺组织匀浆化方法的建立
目的:通过不同匀浆化方法提取大鼠胰腺组织总蛋白,建立胰腺组织匀浆化的标准方法.方法:用液氮研磨分别配合反复冻融法、超声破碎法进行高速分散器分别配合反复冻融法、超声破碎法进行匀浆化胰腺组织,总蛋白提取试剂盒提取胰腺组织总蛋白,测量蛋白浓度并用体积排阻色谱(SEC)分离后分别进行基质辅助激光电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)做蛋白全谱.结果:液氮研磨分别配合反复冻融法、超声破碎法,高速分散器分别配合反复冻融法、超声破碎法总蛋白提取量分别为每0.1g胰腺组织:(6.7±0.5)mg、(6.9±0.2)mg、(5.4±0.2)mg、(5.6±0.2)mg,MALDI-TOF-MS蛋白全谱的谱峰数分别为304.2±22.3、331.6±30.5、263.8±19.7、289.8±12.2个.结论:液氮研磨配合超声破碎法与其他3种方法相比具有匀浆化彻底、蛋白不易变性等优点.
关键词： 蛋白质组学 多维液相色谱 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 匀浆化 -
两种方法提取脑组织总蛋白的色谱串联质谱分析
目的 通过对提取大鼠脑组织总蛋白不同方法 的研究,建立提取脑组织总蛋白的标准方法 .方法 在本实验中分别用总蛋白提取试剂盒和自制裂解液提取脑组织总蛋白,测量蛋白浓度.用体积排阻色谱(SEC)分离后分别进行幕质辅助激光电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)做蛋白全谱.结果 总蛋白提取试剂盒和白制裂解液总蛋白提取量分别为:(5.6±0.2)mg、(6.7±0.5)mg,MALDI-TOF-MS蛋白全谱的谱峰数分别为(304.2±22.3)和(331.6±30.5)个.结论 自制裂解液与常规的总蛋白提取试剂盒相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点.
关键词： 总蛋白 蛋白质组 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 裂解液 -
胰腺组织总蛋白分步提取法的建立
目的:通过对提取狗胰腺组织总蛋白不同方法的研究,建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法.方法:用常规的总蛋白一步提取法和三步提取法,以三种溶解性能不同的裂解液分步提取胰腺组织中的总蛋白,测量蛋白浓度并分别用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectra,MALDI-TOF-MS)做蛋白全谱.结果:一步法和分步法总蛋白提取量分别为(18.8±1.2) mg和(23.3±0.9) mg,MALDI-TOF-MS蛋白全谱的谱峰数分别为(22.2±4.5)个和(32.8±3.8)个.结论:分步法与常规的一步法相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点.
关键词： 总蛋白 蛋白质组 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 提取 -
正常乳腺与乳腺癌核基质蛋白的双相电泳-飞行时间质谱研究
目的:应用比较蛋白质组学方法分析正常乳腺与乳腺癌组织的差异表达核基质蛋白,为人乳腺癌发病机制及其早期诊断的研究提供理论依据.方法:应用双相电泳(2-DE)每组分离4例乳腺组织核基质蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI数据库鉴定蛋白质.结果:每张图谱约检测到900个蛋白质点,共发现27个差异表达蛋白,选择背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子质量及等电点,初步鉴定了12种蛋白质.结论:这些差异蛋白质部分有望成为乳腺癌诊断及治疗的分子标志物.
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小细胞肺癌及其配对的正常肺组织差异表达蛋白质的双相电泳-飞行时间质谱研究
目的 应用比较蛋白质组学方法分析小细胞肺癌(SCLC)与其配对的正常肺组织差异表达蛋白质,为阐明SCLC发病机制、筛选其早期诊断标志物提供有益的思路.方法 应用双相电泳(2-DE)分离6例SCLC及其配对的正常肺组织可溶性总蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI或SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质.结果 每张图谱约检测到800多个蛋白质点.经匹配分析,肺癌组织之间和正常肺组织之间凝胶图像的匹配率分别为75.5%和78.2%;选择14个背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子量及等电点(pI),初步鉴定了u种(六类)蛋白质:①与蛋白质降解通路有关的蛋白质:蛋白酶体α亚单位3型、蛋白酶体β亚单位2型及β亚单位5型;②自由基/抗氧化剂类:锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和黄素还原酶(FR);③细胞骨架类:原肌球蛋白-3(Tpm-3);④与能量代谢有关的蛋白质:硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX1);⑤分子伴侣:抑制素(PHB),内质网蛋白ER29(Erp29);⑥其他:可溶性NSF黏附蛋白(alpha SNAP).结论 应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了11种(六类)蛋白质;这些蛋白质与SCLC发生发展密切相关,部分可能成为SCLC诊断及治疗的分子靶点.
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液质联用技术分析比较基因重组卡介苗与传统卡介苗 Ag85复合体成分
目的：利用液质联用技术分析比较基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗的主要分泌型抗原Ag85复合体成分。方法分别提取基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清中的分泌蛋白，采用反相高效液相色谱（Reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）进行分离，并将终得到的目的蛋白峰采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（ MALDI-TOF-MS ReflexⅢ）进行质谱分析鉴定。结果基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清分泌蛋白Ag85复合体成分有所不同，Aeras-422表达的Ag85复合体成分包括Ag85A和Ag85B两种抗原，传统卡介苗菌株仅分泌表达Ag85A抗原。结论基因重组卡介苗Aeras-422分泌Ag85复合体的能力优于传统卡介苗。为建立新型结核病疫苗的质控方法提供了数据支持。
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聚山梨酯类化合物定性鉴别方法研究
目的:建立聚山梨酯类化合物的核磁共振和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)定性鉴别方法.方法:核磁共振方法采用5 mm BBO探头的核磁共振仪,在温度25℃下,采集一维氢谱和碳谱.一维氢谱弛豫时间2s,谱宽δH 15,采样点数64k,扫描次数128次;一维碳谱弛豫时间1 s,谱宽δ c 236.6,采样点数64k,扫描次数32 768次.MALDI-TOF-MS方法采用MALDI-TOF-MS质谱仪,采样基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA),采样质量范围m/z 500～4 000.结果:MALDI-TOF-MS质谱图中的特征离子峰可有效定性鉴别聚山梨酯20、40和60.核磁共振1H谱、13C谱中的双键信号峰可有效定性鉴别聚山梨酯80.结论:MALDI-TOF-MS法和核磁共振1H谱、13C谱的结合使用可有效定性鉴别聚山梨酯类化合物.
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应用MALDITOF-MS技术对创伤口标本分离的人型支原体快速鉴定及药敏结果分析
目的 探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)技术准确鉴定人型支原体的应用,并分析支原体药敏结果,为临床治疗提供依据.方法 回顾2017年12月-2018年8月应用MALDITOF-MS技术鉴定的微生物中生殖道外感染人型支原体鉴定病例临床资料、病原菌的检验方法 及药敏试验结果 .结果 从351份伤口、切口或创伤分泌物标本培养48h后无菌生长,继续培养至96 h后分离出5株可疑人型支原体,阳性率为1.4％,经MALDITOF-MS技术和PCR技术鉴定均为人型支原体,置信度大于99.2％.人型支原体对强力霉素、交沙霉素、加替沙星、米诺环素均有良好敏感性,而对红霉素、罗红霉素、环脂红霉素、阿奇霉素、克拉霉素均耐药.结论 应用MALDITOF-MS技术能够快速鉴定从伤口、切口等部位分离的人型支原体,可指导实验室进行正确选择药敏试验,为临床提供准确感染诊断和药敏治疗具有重要意义.
关键词： 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 人型支原体 分离鉴定 药敏 -
不同前处理方法在质谱检测胸腹水细菌的探讨
目的 用不同方法对胸腹水进行前处理,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪对标本中细菌进行检测,以期找出佳的胸腹水前处理方法.方法 收集临床各种类型有细菌生长的胸腹水120例,分别使用直接离心集菌、血平板接种短期培养、肉汤短期培养三种方法进行前处理.以常规培养结果作为参考,评价三种方法在MALDI-TOF MS检测胸腹水细菌中的优劣.结果 直接离心集菌法检出率为47.5％;血平板接种短期培养法需时4h,检出率为92.5％,适用于各种类型的标本;需时2h,检出率为85.0％,不适用于乳糜样标本.结论 胸腹水经肉汤短期培养后,MALDI-TOF MS能在相对短的时间内获得高的检出率,但不是所有标本都适用;对乳糜样胸腹水推荐使用血平板接种短期培养法进行前处理.
关键词： 前处理 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 胸腹水 细菌检测
