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H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂对不同现场标本的检测比较
利用H5亚型禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂"H5-HA(Ag)Dot-ELISA(H5-Dot)"对来自陆禽、水禽的484份气管拭子、泄殖腔拭子和粪便拭子标本进行检测,结果:①不同采集方式的H5N1阳性标本的检出率高低有别,气管拭子的检出率高,泄殖腔拭子次之,粪便拭子低(P＜0.05),因此建议现场采样时应尽可能采集气管拭子标本;②陆禽标本检出率显著高于水禽标本(P＜0.05),对病毒培养阳性的陆禽气管拭子检出率达80%(95%CI:70.6%～87.8%),对水禽气管拭子标本的检出率为38%(95%CI:26.9%～49.4%),可能与标本中病毒滴度高低有关;③有症状与无症状陆禽标本的检出率无显著差异.另外,H5-Dot试剂对333份非H5病毒气管拭子标本的特异性为99.4%(95%CI:97.9%～99.9%).这些结果表明,H5-Dot是一种较为可靠的H5亚型禽流感病毒早期快速检测方法,在缺乏仪器设施和高素质专业技术人员的H5N1禽流感病毒防控第一线具有重要推广价值.
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中国台湾地区H6N1禽流感病毒血凝素基因的适应性进化
2013年在中国台湾地区发现了第一例人感染H6N1禽流感,研究该地区H6N1病毒血凝素基因(HA)的适应性进化特征和种群动力学,将为人感染H6N1病毒的来源、进化及致病机制的理解提供更多信息,为进一步的研究和防治提供一定帮助.本研究从Flu和GISAID两大数据库中获得中国台湾地区所有已释放的H6N1病毒的HA序列,构建系统发育树和进化动力曲线,并推测其进化速率,分析其适应性进化特征.结果表明中国台湾地区H6N1病毒的HA有五种类型,其中人感染H6N1病毒的HA所属类型为目前当地优势类型;该病毒种群于1971年底第一次扩张,2008年迅速减少,而后又略有增加.同时在长期的进化过程中,3个位点受到正选择作用的影响,增加了病毒的适应能力;89个位点受负选择作用的影响,它们在病毒的复制、流行中可能具有重要的功能;其中剪切位点附近的329位所受负选择作用强烈(PsLAC0.001、PFEL0.000、BFREL 137),此位点可能与病毒毒力有关.中国台湾地区H6N1病毒的HA已发生了明显的适应性进化,具有发生疫情的可能性,人们应高度重视,并能及时给与监测和防治.
关键词： 人感染H6N1禽流感病毒 适应性进化 进化动力学 血凝素 生物信息学方法 -
一种新型H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂的建立
利用5株广谱特异性抗H5亚型血凝素单克隆抗体和酶联免疫渗滤技术成功地建立了一种适于现场检测H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原快速检测试剂H5-HA(Ag) Dot-ELISA.该试剂对41株代表当前亚洲地区流行的各种遗传变异亚系H5N1禽流感病毒检测均为阳性,对多数毒株的分析灵敏度优于0.1 个血凝滴度 (HA titer),其中部分优于0.01 个血凝滴度;比较该试剂与早期开发的同类ELISA试剂,发现前者对后者未能检出的H5N1新变异株检测均为阳性;利用该试剂和商品化Directigen Flu A(BD)试剂检测两株H5N1病毒株,提示前者灵敏度高于后者;该试剂对一株H5N1病毒的检测灵敏度与标准RT-PCR相当;该试剂对24株非H5亚型病毒检测均为阴性,显示出良好特异性.以上结果提示,此研究建立的H5N1病毒抗原快速检测试剂在H5禽流感现场检测上具有较好的应用前景.
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共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力
为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病性H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE/L调控其转录,定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE/L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9.以FuGeneTM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p11SH5H9与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5H9.通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV- 11SH5H9.以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A.初步的动物试验表明,用105PFU的rF-PV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100%(8/8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100%,显示出一定的应用前景.
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表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究
通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1:10000和1:1000.除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA.滴鼻组的免疫效果强于灌胃组.经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%.该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果.
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共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力研究
将H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因和鸡白介素(chiIL-2)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体p12LS的启动子Ps和P_(E/L)下游,使这两个基因反向串联,构建携带AIV HA基因和chiIL-2基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSH5AIL2.将重组鸡痘病毒转移载体质粒转染至已感染野生型鸡痘病毒282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,经蓝斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-H5AIL2.间接免疫荧光试验表明重组鸡痘病毒能够表达H5亚型AIV HA;RT-PCR和间接免疫荧光试验证实重组鸡痘病毒可表达chiIL-2.SPF鸡和商品蛋鸡的免疫攻毒保护试验表明,经rFPV-H5AIL2免疫的试验鸡的抗体水平显著高于经rFPV-H5A免疫的试验鸡;在SPF鸡中rFPV-H5AIL2免疫组和rPFV-H5A免疫组的攻毒保护率和排毒率相当,但在商品鸡中rFPV-H5AIL2免疫组的攻毒保护率显著高于rFPV-H5A免疫组,而排毒率显著低于后者.本研究为研制新型禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础.
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共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定
以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒.PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA.将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Westernblot方法均检测到M1和HA基因的表达.共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础.
关键词： M1蛋白 血凝素 内部核糖体进入位点序列 腺病毒载体 -
一株抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的广谱中和活性
以H5N1禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02作为抗原,应用常规杂交瘤技术和血凝抑制实验筛选出抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗8H5,单抗8H5经免疫荧光鉴定具有很好的H5特异性.选择33株2002～2006年不同地域,不同宿主中分离的不同遗传变异亚系的H5N1病毒代表株,对单抗8H5分别进行血凝抑制实验及中和试验分析,结果显示单抗8H5对所有H5亚型病毒均有较强反应,而对非H5亚型标准病毒株均不反应,说明8H5是一株广谱性抗H5特异性中和单抗,并提示单抗8H5的HA识别表位可能是一个相当保守的中和表位.并且单抗8H5双抗夹心系统的初步评价显示了其在诊断应用上的前景.
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高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备
利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性.研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒(H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp),H5N1Pp的感染力滴度为108 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台.
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禽流感病毒血凝素HA的可变性解析
以重组的蒙古鸭H5N2禽流感病毒A/Duck/Mongolia/54/01的血凝素HA蛋白的cDNA为模板,进行PCR随机突变,表达只有单个氨基酸突变的H5HA基因共计38个.根据红细胞吸附反应,分析这些突变HA的功能,仍然具有红细胞吸附活性的单个氨基酸突变的HA约占89%,说明H5HA单个氨基酸突变的容许率是相当高的.HA1区突变数目大约是HA2区的两倍.对失去红细胞吸附功能和某些仍然拥有红细胞吸附功能的HA及单个氨基酸突变的位置与结构的关系进行探讨.有两个位点氨基酸突变了两次,但都不影响红细胞吸附功能,对红细胞吸附功能的影响,似乎主要由位置决定,而不是取决于取代的氨基酸的种类.位点179位和122位的突变是不允许的;位点179位于H5N1的受体结合区域RBD内,122位位于A抗原决定簇区附近,推测在H5HA三维结构上,这两个位点位于HA分子的内部,维持着H5HA的结构.HA1Cys位点4和HA2Cys位点148的突变是不允许的.这两个Cys正好形成HA1和HA2连接的桥梁,对维持H5HA结构也是相当重要的.本实验中HA先后失去了三个糖基化位点,但并不影响吸附红细胞的功能.总之,通过实验分析以研究某些氨基酸改变的效果,寻找关键位点是否突变,可以作为评估H5N1野毒株大流行潜力的分子标志.
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共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建
为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA.将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA.提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功.间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA.应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础.
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A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究进展
目前用于免疫人群的流感疫苗多为三价灭活疫苗,包含A型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型和B型流感病毒.多年来的实践表明,三价灭活疫苗是有一定保护效果的.但是,由于流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)经常发生抗原转变和抗原漂移,使其抗原性表现出很大的变异,所以根据流感疫情监测预测的疫苗株也很难产生理想的保护效果.但流感病毒基质蛋白M2的膜外区氨基酸序列高度保守,有可能发展成为具有交叉保护能力的流感疫苗的候选抗原.该文就A型流感病毒基质蛋白M2疫苗的研究作一综述.
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共表达H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力
为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒(流感)的基因工程疫苗,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素(IFN-Ⅱ)全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子(PE/L)的基因片段,定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到HA和IFN-Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体1175HAIFN.以脂质体转染法将1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.1175HAIFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-HA-IFN-Ⅱ.通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA-IFN-Ⅱ.以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实,纯化的rFPV-HA-IFN-Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN-Ⅱ.动物试验表明,rFPV-HA-IFN-Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)抑制1日龄SPF雏鸡增重的副作用.
关键词： H9亚型禽流行性感冒病毒 重组鸡痘病毒 鸡Ⅱ型干扰素 血凝素 -
表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建
用RT-PCR方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到5型腺病毒载体质粒pAd5C中.用此质粒与EcoRI酶切回收的5型腺病毒基因组大片段共转染293细胞,通过PCR初步筛选得到重组病毒.SDS-PAGE电泳、Western blot证明重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白.此重组病毒经滴鼻免疫Balb/C小鼠,ELISA实验证明能诱导小鼠产生针对流感病毒的循环抗体IgG和分泌型抗体IgA.本实验证明,利用E3区缺失的5型腺病毒载体可以用来表达流感病毒血凝素抗原,重组抗原具有良好的免疫原性,有可能发展成为基因工程流感疫苗.
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禽副粘病毒2型(APMV-2)血凝素单克隆抗体的制备与初步应用
禽副粘病毒2型(Avian paramyxovirus type 2,APMV-2)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属,是养禽生产中的一种常见病原,禽类感染较为普遍[1,2].利用单克隆抗体对APMV-2进行相关研究也有一些报道,例如Ozdemir等制备了APMV-2的单克隆抗体,并利用单抗对APMV-2的抗原性差异进行了研究[3].国内张国中等也制备了APMCV-2的群特异性单克隆抗体,并利用制备的单克隆抗体建立了检测APMV-2抗原的双抗体夹心ELISA方法用于临床上对该病毒的检测[4,5].
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云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析
了解云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征.对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析.利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性.2009～2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8％.测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株.甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009～2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 血凝素 神经氨酸酶 -
中国大陆1993～2013年流行的麻疹病毒H1基因型血凝素基因变异特征
为探讨2013年引起中国大陆麻疹复发的麻疹野病毒中和抗原血凝素(Hemagglutinin,HA)的变异动态,本研究对1993～2013年中国大陆流行的麻疹病毒H1基因型血凝素(HA)编码基因和氨基酸变异进行系统分析,为评价中国疫苗对2013年流行的麻疹野病毒的保护效果提供科学依据.选取2013年8株麻疹病毒代表株,扩增HA基因编码区序列(1 854bp)并进行序列测定和分析.从GenBank上下载45株1993～2012年中国流行株、中国疫苗株上海191(S-191)和长春47(C-47)和24株WHO参考株HA基因编码区序列,MEGA5.05构建亲缘关系树和进行氨基酸位点比对,分析重要中和抗原位点的变异.使用BioEdit进行同源性关系分析.根据HA基因序列的亲缘性关系分析,2013年麻疹病毒代表株均位于H1a亚型的第3分支,且2000年以后分离的H1a亚型的麻疹野毒株均属于该分支;8株2013年麻疹病毒代表株核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.6％～99.8％和97.8％～100.0％,与1993～2012年H1a基因亚型麻疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6％～99.6％和97.0％～99.6％,与中国疫苗株S-191和C-47的核苷酸和氨基酸同源性分别为94.3％～94.7％和94.6％～95.4％;与中国疫苗株S-191原型野病毒氨基酸序列比对,1993～2013年麻疹病毒代表株HA主要中和抗原位点未发生重大变异,但包括2013年代表株的近年流行的H1a麻疹毒株在氨基酸第240位由丝氨酸突变成了天冬酰胺(Ser240Asn),导致潜在的糖基化位点NLS238～240的缺失,但H1基因型麻疹病毒均保留有4个潜在的糖基化位点.中国大陆流行的麻疹病毒H1基因型在重要的中和抗原位点均保持稳定,中国使用的麻疹疫苗对中国现流行的麻疹病毒H1a亚型具有较好的保护效果.中国应继续加强流行麻疹病毒血凝素基因的动态监测,以评价我国疫苗对流行麻疹野病毒的保护效果,为我国消除麻疹提供疫苗使用的科学依据.
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2016年云南省哨点医院标本流感病毒流行病学调查及血凝素基因特征分析
了解2016年度云南省哨点医院标本流感病毒的流行情况及其血凝素基因分子特征.对哨点医院采集的22 514份标本使用real-time RT-PCR方法筛选阳性,MDCK细胞进行病毒分离,SPSS软件进行统计分析.选取其中各亚型流感病毒共43株进行基因测序,使用MEGA5.0软件分析其血凝素基因特征.2016年共检出阳性标本1 310份(阳性率为5.82％),全年有两个流行高峰.甲型H1N1亚型流感病毒属于6B.2和6B.1分支;H3亚型流感病毒主要为3C.2a分支;Bv型流感病毒为1A和1B支系,By型则均属于Yamagata 3支系.部分毒株发生糖基化位点数量改变.2016年云南省流感病毒主要以Bv亚型为主,By、H3与甲型H1N1共流行的流行特点.各亚型流感病毒HA基因未发生明显变异,疫苗株仍具有保护作用.应继续加强流感监测,控制流感流行风险.
关键词： 流感病毒 Real-time RT-PCR 血凝素 -
广州2006年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特性分析
为了解2006年广州地区流行的乙型流感病毒株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的基因特性,选择病原学监测病毒株和暴发性疫情病毒株,提取病毒RNA并逆转录为cDNA,通过PCR方法扩增乙型流感病毒HA和NA全长基因,将扩增的DNA片段接入T-A克隆载体进行测序,并使用DNAStar软件对测序结果进行分析.结果显示:不同来源的流感病毒株HA的同源性为99%以上,都属于Victoria系;不同来源的病毒株NA同源性为98%以上.HA和NA的种系发生树分析表明:病原学监测毒株同源性更接近,而暴发性疫情毒株的同源性则相对较为分散.所有毒株与WHO推荐的2005～2006年度疫苗株B/Shanghai/361/2002的同源性只有88.9%～89.7%,说明该年度的流感疫苗对乙型流感不能提供佳的保护.
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1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究
为了探讨中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行关系,对1995～2005年中国分离的550株H3N2流感病毒的HA1序列进行分析.HA1基因进化树显示出以很长的主干和很短的侧枝为特征.HA1的氨基酸位点变异主要位于5个已知的抗原位点及其附近,同时其它位点也有改变.通过对HA1序列资料分析发现这期间导致H3N2流行的序列改变的三种可能,第一种是同时出现多位点变化,第二种是位点变化逐渐发生累积到多个位点变化,第三种是单个抗原位点和受体结合位点同时改变,均可以引起H3N2流行.
