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高致病性禽流感的流行及其预防控制
禽流行性感冒(简称禽流感,Avian influenza,AI)也称禽流感综合征,是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的急性、高度致死性、烈性传染病.该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单.AIV依据其外膜血凝素(Hemagglutinin,H)和神经氨酸酶(Neuraminidase,N)抗原性的不同,目前至少可分为15个H亚型(H1～H15)和9个N亚型(N1～N9).由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表)所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI),其发病率和病死率都很高,危害极大[1,2].自1997年报道禽类H5N1亚型流感病毒感染人类以来,相继有H9N2、H7N7亚型感染人类和H5N1再次感染人类的报道,引起了世人的广泛关注[1],AIV威胁着人类和动物的健康.
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禽流感病毒的变异进化及其预防控制
流感病毒属于正粘病毒科,为有包膜单链负股RNA病毒,其基因组由7或8个基因片段组成.流感病毒包膜上有两种重要的表面蛋白,血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuramidinase,NA),尤其是HA分子,除了能够和宿主细胞表面的HA受体特异性结合、介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合外,也是机体免疫系统识别和攻击的主要靶点[1].
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H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析
目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性.方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316.候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1 蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.
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禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的研制和初步应用
目的:获得特异针对禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体.方法:以H9N2亚型病毒制成疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,取细胞上清用HI筛选.结果:共获得9株稳定分泌针对血凝素蛋白抗体的杂交瘤细胞;经广谱性和特异性鉴定,所有单抗株均能与所有检测的82株不同年代不同地方不同禽源H9亚型流感病毒大部分分离株反应,且所有单抗株均不与非AIV-H9病毒反应,而其中一株(8E6)能与所有检测的H9亚型病毒株反应.进行Western blot分析显示,其中8株单抗能与AIV的Mr为75 000处反应,表明是针对AIV H9 HA的单抗.结论:本试验获得9株广谱性特异性很好的单抗,特别是8E6株;这些单抗株为以后作病毒抗原性位点分析、临床检测和流行病学调查提供了良好试剂.
关键词： H9亚型禽流感 血凝素 单克隆抗体 Western blot -
双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达
目的 构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体,并在幼仓鼠(BHK)细胞中进行表达.方法 通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段,在融合片段间引入具有柔性功能的(G_4S)_3 linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A linker.将融合后的基因片段H5HA-H7HA克隆至真核表达载体pVAX1.选用BHK真核表达细胞系,用脂质体转染法将纯化后的表达质粒在细胞进行表达,转染后48 h,用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达情况.结果 表达双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA 经酶切和测序证明构建正确.转染重组质粒的BHK细胞可检测到目的蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA,并在BHK真核细胞中正确表达,为H5、H7双亚型核酸疫苗的研究奠定了基础.
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CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定
目的 构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位.方法 分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒.构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CT-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位.结果 重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确.37℃,1 mmol/LIPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量高.约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上.FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性.结论 已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒.并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础.
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2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析
目的 分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征.方法 对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒,经RT-PCR扩增血凝素(H)基因片段,克隆到pMD19-T载体,进行酶切鉴定及序列测定,并分析核苷酸序列,与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较.结果 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570 bp的片段,克隆至pMD19-T载体后,酶切鉴定结果与预期相符.3株麻疹病毒均属H1基因型,其H基因之间同源性为98.5%～99.6%,与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比,在核苷酸水平上大变异为9.7%.3株病毒与H1a参考株Chin93-2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0.007～0.015、0.013～0.021和0.015～0.023.结论 H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株.
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生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1的基因分析
目的 分析生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1基因变异对病毒特性的影响.方法 比较2005-2008年间上海生物制品研究所流感病毒H3N2型各疫苗株的生产数据,并对H3N2型各疫苗株的HA1基因序列数据进行分析.结果 各疫苗株中,A/New York/55/2004(NYMCX-157)的血凝素得率高,A/Brisbane/10/2007(IVR-147)低;2006-2007年度疫苗候选株A/Wiseonsin/67/2005(NYMCX-161B)的病毒复制能力优于A/Hiroshima/52/2005(IVR-142);各疫苗株的氨基酸差异均未直接涉及到HA1蛋白二硫键组成位点,直接涉及到HA1蛋白抗原决定簇位点、HA1蛋白糖基化位点和HA蛋白受体结合位点的变异分别有3处(140、156和193位)、1处(165位)和1处(225位).结论 2005-2008年间各流感病毒疫苗株血凝素得率因株而异,HA1蛋白抗原决定簇位点变异属于正常的不同毒株问的差异;糖基化位点、二硫键组成位点和受体结合位点基本保守;还需进一步研究部分位点氨基酸变异是否与病毒复制能力密切相关,并探讨改善复制能力的可能性.
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微柱凝胶法与试管抗人球蛋白法检测静注人免疫球蛋白中抗A、抗B血凝素滴度效果的比较
目的 比较微柱凝胶法与试管抗人球蛋白法检测静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)中抗A、抗B血凝素滴度的效果.方法 分别采用微柱凝胶法与试管抗人球蛋白法检测34批IVIG样品以及1批IVIG抗A、抗B血凝素大效价国际标准品(07/310)中的抗A、抗B血凝素滴度,并分析两种方法检测结果的相关性、灵敏度和重复性.结果 两种方法检测抗A、抗B血凝素滴度的结果均呈高度正相关性(r值分别为0.809 4和0.834 9,P均＜0.05);微柱凝胶法的灵敏度比试管抗人球蛋白法高约2个滴度;微柱凝胶法较试管抗人球蛋白法具有更好的重复性.结论 微柱凝胶法与传统的试管抗人球蛋白法相比,具有高度相关性、更高的灵敏度和更好的重复性,可用于IVIG中抗A、抗B血凝素滴度的测定.
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四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量检测方法的验证
目的 验证四价流感病毒裂解疫苗[quadrivalent influenza vaccines(split virion) inactivated,QIV]血凝素含量检测方法的可行性.方法 采用传统的单向免疫扩散法(single-radial immunodiffusion,SRID)检测QIVH1N1和H3N2型的血凝素含量,双价抗原参考品SRID法检测两种B型(包括B/Yam和B/Vic)血凝素含量,并对该检测方法进行准确度、精密度、专属性及线性验证.结果 QIV各型的血凝素含量总体回收率为97.8％ ～ 107.6％,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.59％ ～1.83％;试验间和试验内RSD均＜5.0％;4个型别血凝素含量在10 ～ 50 μg/ml范围时,标准曲线呈良好的线性,R2均大于0.980 0,定量限分别为:H1N1:4.53 μg/ml,H3N2:3.83 μg/ml,B/Yam:2.89 μg/ml,B/Vic:5.60 μg/ml;各型别流感裂解疫苗供试品和抗原参考品与对应抗血清参考品出现沉淀环,与非对应抗血清参考品不出现沉淀环.结论 QIV血凝素含量检测法是可行的.
关键词： 四价流感病毒裂解疫苗 血凝素 单向免疫扩散法 抗原 参考品 -
3种细胞基质制备的麻疹血凝素效价的比较
目的 比较3种细胞两种培养基制备的麻疹血凝素的效价.方法 分别采用含10％新生牛血清的MEM培养基和含0.2％水解乳蛋白的199培养基培养原代人羊膜细胞、传代人羊膜细胞(FL)和Vero细胞,以0.01 MOI麻疹病毒L4株感染细胞,收获原制血凝素,采用Tween-80/乙醚处理,经血凝试验监测血凝素佳收获时间,并测定原制血凝素和血凝素效价.结果 采用MEM培养基培养的FL和Vero细胞在感染麻疹病毒后10～11d,血凝素效价高,均可达1:16,原代人羊膜细胞在感染麻疹病毒后14 ～ 15 d,血凝素效价高,可达1:128;采用199培养基培养的FL和Vero细胞所制备的麻疹原制血凝素和血凝素效价均大于1:32,高于MEM培养基组(1:16),而原代人羊膜细胞所制备的麻疹原制血凝素和血凝素效价均为1:128.结论 3种细胞两种培养基均可用于制备麻疹血凝素.
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B型流感病毒血凝素的纯化
目的 纯化B型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA).方法 使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA,超速离心获得含HA的上清后,经蔗糖密度梯度离心进行纯化,HPLC分子筛分析纯化效果.纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后,切取丰度较高的蛋白条带,进行质谱鉴定.结果 病毒蛋白与菠萝蛋白酶蛋白含量的佳比例为40:1;5％ ～ 30％梯度浓度的蔗糖能很好地去除低相对分子质量的蛋白,流感病毒内丰度较高的NP及M蛋白得到很好的去除;纯化的HA蛋白的纯度大于90％,且HPLC分析显示仅有1个主峰,均一性良好.结论 优化了B型流感病毒HA蔗糖密度梯度离心纯化方法,获得了高纯度的HA蛋白,为制备HA标准抗血清奠定了基础.
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去氧胆酸钠裂解流感病毒的效果研究
目的研究去氧胆酸钠对流感病毒佳的裂解条件.方法流感病毒在不同浓度的去氧胆酸钠作用一定时间后,经蔗糖梯度密度离心纯化,制备出流感裂解疫苗样品.以电镜观察病毒裂解情况和血液凝集反应,测定病毒效价作为评价指标,确定佳裂解条件.结果裂解纯化后的样品经电镜、SDS-PAGE检测表明病毒颗粒完全裂解,裂解后的血凝效价收率约为80%.结论0.8%的去氧胆酸钠作用120min可使流感病毒达到佳裂解效果.
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流感疫苗血凝素含量检测方法的研究进展
目前流感疫苗血凝素含量常用的检测方法是单向免疫扩散法(Single-radial immunodiffusion,SRID).为了解决大流行流感发生初期无法获得参考品的情况,提高流感血凝素检测方法的灵敏度、重复性、准确性,人们从物理化学和免疫化学两个方面对SRID的替代方法进行了探索性研究.本文对近1 0年来对流感疫苗血凝素含量测定方法的研究进展作一简要综述.
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铝吸附流感疫苗中血凝素含量检测方法的建立
目的 建立铝吸附流感疫苗中血凝素(HA)含量的检测方法.方法 选用不同的解离液,在不同的条件下对铝吸附疫苗进行解离,以单向免疫扩散法(SRID)检测血凝素含量,比较回收效果,并对选取的解离方法进行初步验证.结果 经解离液A处理后,测定HA的回收率为71%～80%,而解离液B的回收率在96%～110%之间.对不同温度、作用时间等考察,终确定以解离液B在室温解离2 h后进行检测.该方法试验内和试验间变异系数均小于20%.结论 采用解吸附结合传统SRD方法测定铝吸附流感疫苗中HA含量,重复性好,准确度高,可代替动物接种法.
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流感疫苗株H3N2(NYMCX-223A)主要抗原基因特征与传代稳定性
目的 分析2013年流感疫苗生产用甲型H3N2(NYMCX-223A)毒株主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征,并检测该疫苗株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性.方法 对制备的H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检测;采用RT-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析;应用MEGA 5.05软件对7株不同年份的H3N2亚型疫苗株的HA氨基酸序列进行比对,绘制基因种系发生树.结果 H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批抗原性与2013年度WHO推荐毒株相一致,其他生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;主要抗原HA基因序列长度为1 701 bp,编码566个氨基酸;NA基因序列长度为1 410 bp,编码469个氨基酸,各代次流感病毒HA和NA基因核苷酸和氨基酸序列均一致,与GenBank公布的序列完全一致,同源性为100％.2013年与2012年H3N2疫苗株HA氨基酸序列相比,同源性为97.5％.2013年与2012年H3N2疫苗株具有较远的进化距离,与同源性结果相对应.结论 2013年甲型H3N2(NYMCX-223A)流感疫苗株主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合《中国药典》三部(2010版)要求.2013年与2012年H3N2疫苗株序列差异较大.
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H7N9流感病毒血凝素球状区的原核表达及免疫原性评价
目的 原核表达H7N9流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)球状区,并评价其免疫原性.方法 根据H7N9流感病毒HA晶体结构,设计含有2对和3对二硫键的球状区结构域HA 1S (62-284 aa)和HA1L(57-289 aa),扩增后连接至pET-21b(+)载体,构建重组表达质粒pET-21b(+)-HA1S和pET-21b(+)-HA1L,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的包涵体经复性和柱层析纯化获得球状区蛋白.纯化的目的蛋白分别以CpG X1、Al(OH)3和CpG X1+Al(OH)3为佐剂免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平和中和抗体水平,评价其免疫原性.结果 重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确.两个目的蛋白能在大肠埃希菌中表达,经稀释复性和柱层析纯化后均为单体,HPLC检测纯度均大于95％.动物试验结果表明,单独使用CpG X1或Al(OH)3不能增强免疫应答,同时使用CpG X1+ Al(OH)3能将IgG抗体水平提高3倍左右.体外假病毒中和试验结果表明,中和抗体水平均较低.结论 在大肠埃希菌中高效表达了H7N9 HA1S和HA1L两个蛋白,纯化后的蛋白为均一稳定的单体,且具有一定的免疫原性,为进一步研发快速生产H7N9流感病毒基因工程疫苗提供了参考.
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H7N7亚型马流感病毒单克隆抗体的制备
目的 制备抗H7N7亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的单克隆抗体,以建立特异、灵敏、简便的H7N7亚型流感病毒金标试纸检测方法.方法 以H7N7亚型EIV为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过血凝抑制(HI)试验和间接ELISA筛选能稳定分泌抗H7N7亚型EIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其分泌的单抗进行生物学特性鉴定.结果 筛选出3株能稳定分泌抗 H7N7亚型EN单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5B2、1C10和2B7;5B2和100株单抗为IgG2a亚型,2B7单抗为IgGM亚型,轻链均为K链;3株单抗均只与H7N7亚型EIV发生特异性反应,而不与H3N8亚型EIV、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马乙型脑炎病毒(JEV)发生交叉反应,特异性良好.结论 已制备出3株针对H7N7亚型EIV的单克隆抗体,为H7N7亚型马流感疫情的快速诊断以及流行病学调查提供了良好的材料.
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2011年流感疫苗批签发情况总结与质量分析
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病.据统计,全球每年约有5％～15％的人口感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和约50万的死亡病例[1].接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段[2].
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2006～2009年流感疫苗批签发情况总结与质量分析
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病,具有传染性强、传播速度快的特点.据报道,全球每年约有5%～15%的人口会感染流感病毒,并导致300万～ 500万的严重病例和50万的死亡病例[1-2].接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段[3].
