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六株不同地区分离的H7N9流感病毒假病毒制备与生物学特性研究
目的 选择不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株,制备各代表株的假病毒,为H7N9疫苗对不同地区毒株的免疫保护效果评价奠定基础.方法 通过对29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的氨基酸序列分析,获得6株不同地区H7N9亚型流感病毒代表株病毒;采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,以HA与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)作为包膜质粒,包装获得6株带有荧光素酶报告基因的假病毒;通过电镜负染、Western blot检测、感染MDCK后的荧光素酶读值和血凝试验等了解6株假病毒的生物学特性,通过血清交叉中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况.结果 筛选获得6株不同地区分离的H7N9流感病毒代表株并制备了相应的假病毒颗粒,电镜下可观察到典型的流感病毒形态,Western blot可检测到HA、NA和P24的表达;滴度测定结果显示6株假病毒对MDCK细胞的感染力为104～ 105TCID50/50μl,血凝活性可达64～ 512;SH1上海株H7N9 HA疫苗免疫血清针对6株流感假病毒100TCID50剂量的中和效力不同,提示6株假病毒可用于疫苗的交叉免疫效果评价.结论 成功获得6株H7N9不同地区代表株流感假病毒,为疫苗的免疫效果评价奠定了基础.
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来源于H5N1患者的VH1-2编码广谱抗体的筛选与功能研究
目的 从禽流感H5N1患者体内筛选分离抗流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)广谱中和性抗体.方法 通过B细胞体外培养、抗体可变区基因筛选及表达等技术,建立H5N1患者外周血中交叉反应性B细胞及H5N1假病毒中和活性B细胞的抗体基因文库.利用293T细胞表达系统体外表达抗体库,使用ELISA及假病毒中和试验筛选潜在的广谱抗体,并鉴定其功能.结果 获得由VH1-2编码的抗体基因,其编码抗体可广谱结合H1,H5,H6,H9及H7亚型,并对GX-H5N1假病毒有良好的中和能力,该类抗体轻链为VK3-20/Jκ4和Vκ3-20/Jκ5.结论 H5N1病毒感染可诱导产生广谱反应性抗体.
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2001年中国新分离维多利亚系乙型流感病毒的抗原性及基因特性分析
目的研究2001年中国新分离维多利亚(Victoria)系乙型流感病毒的抗原性及基因特性.方法鸡胚传代流感病毒,从尿囊液中提取流感病毒的RNA,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序,然后用MegAlign软件进行基因种系发生树分析. 结果 B/Sichuan/63/2001和B/Zhejiang/2/2001毒株的抗原性与B/Shandong/7/97毒株间存在有差异,编码血凝素重链区基因已发生了突变并导致了HA1蛋白抗原性表位两个位点(197和199)氨基酸不同于B/Shandong/7/97毒株,基因种系发生树分析同样也证明了它们的HA1基因不同于B/Shandong/7/97病毒.然而B/Sichuan/63/2001与B/Zhejiang/2/2001毒株间无论抗原性还是HA1基因特性均很相似.结论 2001年我国人群中流行的乙型流感病毒维多利亚毒株系的抗原性已发生进一步的漂移.
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深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA-UTR基因分子特征分析
目的 了解深圳市H5N6、H7 N9流感病毒HA基因非翻译区(Untranslated region,UTR)的分子特征.方法 使用MEGA7.0、DNAStar7.1.0等生物信息学分析软件对全球及深圳H5N6、H7N9流感病毒HA基因的UTR进行核苷酸序列同源性分析及基因多态性分析.结果 3株2014-2015年深圳市H5N6病毒与其他H5NX病毒株比较,HA-3'UTR核苷酸同源性为77.4％～100％,H5N6-HA-3'UTR未见明显突变位点;HA-5'UTR核苷酸同源性为91.7％ ～ 100％,H5N6-HA-5'UTR第24、31位发生突变.11株2013-2014年深圳市H7N9病毒与其他H7NX病毒株比较,HA-5'UTR核苷酸同源性为81.2％ ～100％,H7N9-HA-5'UTR在第2～6、9、10、12及15 ～ 17位发生多位点突变.结论 深圳市人感染H5N6及H7N9病毒HA的UTR保守区高度同源性及其可变区具有基因多态性.
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H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位预测方法研究
目的 对H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白抗原表位预测方法进行研究.方法 用H1N1流感病毒裂解疫苗常规法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合、克隆化筛选,获得特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记各株mAb,ELISA阻断试验检测各mAb相互阻断结果;克隆各mAb的轻链和重链可变区基因,并用计算机模拟预测各mAb结合HA抗原表位的氨基酸位点.结果 获得稳定分泌抗H1N1流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞3株;ELISA阻断试验将3株mAbs分为2类;计算机模拟预测将3株mAbs也分为2类.结论 ELISA阻断试验和计算机模拟预测在解析H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位时可以相互佐证.
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整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建
目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.
关键词： H5N1型禽流感病毒 血凝素 假病毒 逆转录病毒 -
2014—2016年福建省H3 N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析
目的 了解2014—2016年福建省H3N2亚型流感病毒血凝素( HA)基因特征及其变异情况.方法 随机选取44株病毒,对病毒的HA基因进行扩增和测序;然后利用生物信息学软件和在线分析网站对序列进行拼接、校对、相似性与差异性比较以及基因进化树构建等基因特征分析.结果 44株H3N2亚型流感病毒HA基因核苷酸相似性在97. 3% ～100. 0%之间,2014年、2015年与2016年流行株与对应疫苗株之间的平均基因差异分别为0. 012、0. 008和0. 009. 2014年流行株的基因型为3C. 3a,与疫苗株3C. 1不同,2015年与2016年流行株与疫苗株的基因型相同,但其抗原表位、受体结合位点和糖基化位点发生了变异.结论 2014—2016年福建省H3N2亚型流感病毒逐年发生变异,显示出逃避疫苗免疫作用的能力,应加强流感监测,以及时发现变异情况,为流感防控提供科学依据.
关键词： H3N2亚型流感病毒 血凝素 基因特征 变异 -
甲型H1N1流感病毒HA63-286蛋白的原核表达及免疫原性初步研究
近年来,随着甲型H1N1流感的不断暴发,对新型流感疫苗的开发和安全应用越来越得到重视.对甲型H1N1的血凝素(HA)第63～ 286氨基酸区进行基因克隆,并将其插入到大肠杆菌表达载体pTXB1中进行表达,对其免疫原性进行了初步的研究,为开展基因工程疫苗和核酸疫苗研究提供了资料.
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2012-2017年杭州地区甲型H3N2流感病毒HA和NA基因遗传进化分析
目的 了解2012—2017年杭州地区甲型H3N2流感病毒的流行情况以及血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化特征.方法 收集2012年1月至2017年12月间杭州地区流感样病例12185例,实时RT-PCR检测甲型H3N2流感病毒,同时选取部分甲型H3N2流感病毒阳性样本,用特异性引物扩增HA和NA基因,进行基因测序并分析其遗传进化特征.结果 自2012年以来,杭州地区每年都有甲型H3N2流感病毒的流行.不同年龄段人群发病率存在统计学差异,趋势性卡方检验发现,随着年龄增长,发病率显著提高(Z=81.039,P<0.05).2012年以来,杭州地区流行的甲型H3N2流感病毒主要属于3C.3a和3C.2a两个进化簇.HA和NA基因的序列一致性均为96.7％ ～100％,但在多个抗原位点发生了突变.结论 甲型H3N2流感病毒在杭州地区流感流行中具有重要地位.2012—2017年,杭州地区甲型H3N2流感病毒抗原变异明显,但目前并未发现耐药株的出现和流行.
关键词： 甲型H3N2流感病毒 血凝素 神经氨酸酶 遗传进化 -
广东新型甲型H1N1病毒血凝素基因分子进化与变异
目的 揭示广东地区2009-2011年新型H1N1病毒血凝素基因(HA)进化特征及抗原表位变异特征.方法 采用时空抽样方法抽样,检测2009-2011年广东分离的24株新型H1N1病毒HA基因核苷酸序列,与GenBank中44株国外相应序列比较；比对HA基因核苷酸序列,分析基因分子变异,构建分子遗传动力学MCMC进化树；同时分析2009-2011年广东毒株HA基因的抗原表位变异情况.结果 68株HA基因进化树显示,广东毒株进化树主干至少分为6大分支；其中2011年毒株聚类为2个(Ⅴ和Ⅵ)主要分支,各具基因特征.变异频率较高的位点包括391、467、202和214位,正向选择位点包括8、145和391；广东毒株抗原表位区发生S145L/P、L208I、Q240R、S160G和G187R位点变异.2009年广东毒株HA基因分支Ⅰ毒株可能于2010年传播到亚洲、欧洲和澳洲地区.结论 广东新型H1N1病毒HA基因变异具有传播特征(Ⅰ)和地区特征(Ⅵ),位于抗原表位Ca、Sa和Sb的氨基酸发生变异,其中位点145等变异频率较高,承受着正向选择压力.
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江苏省2011年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子流行特征
目的 分析2011年江苏省乙型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子流行特征.方法 选择13株2011年江苏省不同地区、不同流行时间的乙型流感毒株进行全基因组测序,通过生物信息学方法对HA、NA分子流行特征进行分析.结果 13株乙型流感毒株中,10株属于Victoria系,3株属于Yamagata系.10株Victoria系毒株的NA基因来源于Yamagata系病毒,是基因重配流行株.与疫苗株相比,10株Victoria系毒株和3株Yamagata系毒株的HA蛋白分别在197和196位增加一个糖基化位点.结论 2011年江苏省乙型流感Victoria系和Yamagata系病毒同时流行,其中重配的Victoria系病毒占优势.
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2013-2014年江苏省H3N2亚型流感血凝素分子特征分析
目的 分析2013-2014年江苏省H3N2亚型流感病毒HA基因变异规律及其遗传进化特征. 方法 从2013-2014年江苏省流感病原监测中分离到的季节性H3N2亚型流感毒株中,选取不同时间段、不同地区具有代表性的31株分离毒株,提取病毒RNA,利用自行设计的特异性引物通过RT-PCR扩增HA基因片段,将PCR产物纯化、测序并分析其遗传进化特征. 结果 31株分离株与疫苗株A/Texas/50/2012的核苷酸和氨基酸进化距离分别为0.010 5、 0.012 4,核苷酸与氨基酸的同源性分别为97.9%~99.6%、97.2%~99.3%.遗传进化分析结果表明,分离毒株的HA基因分属不同的进化分支,2013年的3株分离毒株独立形成Group 1;3株2014年江苏省分离株位于Group 2;其余位于Group 3.选择性压力分析通过REL模型得到3个正向压力选择HA氨基酸位点分别是237、366、367.与疫苗株相比,分离毒株分子特征表现为发生N128A/T和P198S/A(去信号肽排列)氨基酸位点变异,均位于B抗原决定簇;分离毒株抗原决定簇上发生变异的位点累计24个;7株分离株出现126NWT糖基化位点,3株分离株糖基化位点45NSS和144NNS消失.流感疫苗的效果评估结果显示,疫苗对江苏省季节性H3N2流感的保护效果不理想. 结论 江苏省2013-2014年H3N2亚型流感病毒的HA基因相较于疫苗毒株发生较大变异,疫苗对病毒的预防效果不理想,使得H3亚型成为当年的优势毒株.
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动物源性和人源性甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的特征分析
目的 研究动物源性和人源性甲型H1N1流感病毒(influenza A virus)血凝素(hemagglutinin,HA)的特征,以探讨动物源性和人源性甲型H1N1流感病毒血凝素之间的关系.方法 从美国生物信息中心(NCBI)下载禽(鸟)源、猪源、人源的甲型H1N1流感病毒血凝素氨基酸序列,使用Clustal W2.0生物学软件比较上述血凝素氨基酸序列,并建立甲型H1N1流感病毒血凝素氨基酸序列的进化树.结果 2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列同源性非常高,达到了99%～100%,而2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列和禽(鸟)源,猪源的甲型流感病毒血凝素氨基酸序列之间的同源性非常低,只有77%～90%(只有猪源ABW36355和2009年分离的人源甲型流感病毒血凝素氨基酸序列同源性为90%,余同源性为77%～83%);蛋白生物进化树表明禽源(鸟)、猪源、人源的甲型流感病毒血凝素氨基酸序列明显分为3个大的分支.2009年分离的人源性甲型流感病毒血凝素氨基酸序列(ADA71154除外)与疫情前分离得到的人源的血凝素氨基酸序列同源性很低(79%～80%),并且进化树分为3个分支.结论 2009年流行的甲型H1N1流感病毒是一种新的流感病毒,病毒的血凝素氨基酸序列之间的同源性非常高,而和猪、禽(鸟)源的甲型H1N1流感病毒的血凝素氨基酸序列之间的同源性非常低,从这一层面上来讲,目前流行的甲型流感病毒的血凝素的基因并不是猪源和禽源,和疫情前人源的血凝素比对的结果也表明,2009年流行的甲型H1N1流感病毒也并不是直接源于2009年以前的人源流感H1N1病毒,而应该是另有来源.
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抗甲型流感病毒血凝素通用抗体的制备及鉴定
目的 建立针对甲型流感病毒血凝素的通用抗体.方法 通过对流感病毒数据库中血凝素基因的分析,寻找保守的序列并合成多肽.将多肽耦联在载体匙孔血监蛋白(KLH)上,多次皮下免疫家兔,制备高效价抗体.结果 序列分析发现血凝素第二亚单位(HA2)上氨基端14个氨基酸极端保守,耦联多肽经4次免疫后效价达到1:80000,以免疫印迹方法证明此通用抗体能与流感病毒H1～H13亚型的血凝素蛋白特异反应.结论 通过寻找保守蛋白并耦联在合适载体上,免疫家兔获得了针对甲型流感病毒血凝素抗原的通用抗体.
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抗A型流感病毒广谱中和抗体及广谱通用疫苗研究进展
接种流感疫苗是预防和控制流感流行的有效手段,可诱导广谱、长期保护作用的通用流感疫苗研究尚处于初级阶段.现已鉴定报道了几个广谱中和抗体可以抵抗多种A型流感病毒,病毒表面抗原血凝素(haemagglutinin,HA)与抗体的复合物晶体结构揭示了至少3个高度保守表位.深入了解中和抗体与抗原互作分子机制可以为合理设计通用流感疫苗提供新策略,同时对开发新的抗流感病毒治疗抗体药物也具有重要启示意义.本文综述了A型流感病毒广谱中和抗体和广谱通用疫苗的研究进展.
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幽门螺杆菌黏附素HpaA的克隆、表达及生物学活性研究
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种慢性、感染率高的细菌,是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因子,并与胃癌、胃相关淋巴组织瘤密切相关.Hp感染基本的条件之一是黏附定居,N-乙酰神经氨酰乳糖结合血凝素(NLBH,HpaA)是Hp众多黏附素中的一种,可激发宿主产生相应抗体,引起黏膜和全身性免疫应答,针对它所产生的抗体不与非Hp细菌和人胃黏膜组织发生交叉反应,是Hp的保护性抗原之一.
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2011-2015年广东省H3N2亚型流感病毒血凝素基因变异和进化分析
目的 揭示2011-2015年广东地区甲型H3N2毒株血凝素(HA)基因进化特征和变异特点.方法 采用时空抽样方法抽样,测定2011-2015年广东甲型H3N2毒株HA核苷酸序列,同时检索全球HA序列作为对照,采用MEGA5.05、BEAST v1.7.0和BioEdit7.1.3软件对HA基因核苷酸序列进行比对和分析.结果 广东48株H3 N2流感病毒的HA序列核苷酸同源性为96.4％～100.00％,2013-2015年广东H3 N2亚型流感病毒HA基因与南半球疫苗株A/Switzerland/9715293/2013的同源性为97.8％ ～98.7％,抗原性较为接近.序列系统进化分析显示,其进化规律都是沿着树枝主干随着时间推移向上延伸,广东毒株主要分布在3C.3a分支,2015年部分毒株出现在3C.2a分支.2011-2015年HA基因共出现1 16个氨基酸位点突变,其中12个氨基酸位点突变涉及4个抗原表位,N241D(N225D)和K192C突变发生在受体结合部位和其中的190螺旋区内.结论 2011-2015年广东甲型H3N2毒株HA抗原变异明显,抗原变异的积累可能出现抗原漂移和流感暴发,应该加强流感病原学监测,及时发现新的流感变异株,为流感防控和降低流感对公众健康危害提供科学依据.
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流感疫苗中血凝素定量检测方法的评价
流感病毒分为甲、乙、丙三型,其中甲、乙型流感病毒的基因组均含8个节段,丙型流感病毒含7个节段.甲、乙型流感病毒的8个基因节段分别编码血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、三种多聚酶蛋白(PBl、PB2、PA)和非结构蛋白(NS).
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2004年冬季北京患儿中低滴度甲3型流感病毒HA1基因特性分析
目的分析2004年流感流行季节北京地区流感样病患儿患者分离的低滴度甲3型流感病毒血凝素(HA1)基因的特性.方法用2004年流感流行季节分离的22株低滴度甲3型流感病毒提取病毒RNA,经RT-PCR扩增得到HA1区基因片段.用生物信息软件分析HA1区基因特性.结果扩增的血凝素HA1区基因均为987bp.22株HA1氨基酸序列与当年的疫苗参考株比较,发现氨基酸变异,变异位点在3个抗原决定簇(A、B、D)和受体结合部位的位点,提示本流行季节的流感病毒变异较大,与世界卫生组织推荐2005年疫苗参考株比较,与南半球参考株有2个抗原决定簇(A、D)的氨基酸存在不同,与北半球参考株无明显差异.还发现1株变异,在高保守受体结合部位的底部98位氨基酸也发生了变异.结论2004年冬季流感流行株的变异倾向值得密切关注.
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流行性感冒疫苗与药物的预防作用
流行性感冒(流感)病毒属于正粘病毒科,外有包膜,直径80～120 nm,形态多变,可呈球型或丝状.在病毒表面包裹着糖蛋白血凝素(H)和神经氨酸酶(N),根据抗原蛋白的不同,流感病毒可分为A、B、C亚型,流感病毒B和C只感染人,而流感病毒A除感染人外还可感染鸟类、马、猪、海洋哺乳动物等.
