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人乳头瘤病毒16型E7变异株免疫原性研究
采用分子克隆技术,构建E7变异株重组质粒[pcDNA3.1-(by)E7]和E7标准株重组质粒[pcDNA3.1-(ys)-E7],并将两种质粒分别皮下免疫Balb/c小鼠,免疫后于不同时间提取小鼠血清和制备脾淋巴细胞悬液,分别用ELISA法和MTT比色法检测特异性抗体和特异性淋巴细胞增殖反应.基因免疫后,ELISA法显示,HPV16 E7变异株和标准株均能诱导特异性抗E7抗体;MTT比色法显示,E7标准株免疫组脾淋巴细胞在体外受到变异株E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应,变异株E7免疫组脾淋巴细胞经过同样处理后,出现非特异性淋巴细胞增殖反应.结果表明HPV16E7变异株能诱导特异性体液免疫应答而不能诱导特异性细胞免疫应答,HPV16 E7变异株无论在结构还是免疫原性上均与标准株有差异.由此推测,HPV16E7变异可能导致其逃逸机体自然感染或疫苗诱导的免疫应答.用基因免疫方法研究E7变异株免疫原性也为其它不能或难以进行体外培养的病毒变异研究提供借鉴.
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不同地区HPV16E7基因的克隆及序列差异分析
采用PCR扩增、pGEM-T载体克隆和核苷酸序列分析的方法对一 例武汉地区及两例五峰县高发区宫颈癌患者体内HPV16型的E7基因编码区进行序列分析并与 野生型(德国标准株)及已发表的HPV16湖北株(HPVHB)进行了比较.结果发现武汉地区HPV16 型E7基因仅第54位出现一个同义突变,而高发区HPV16型E7基因存在差异,第77位氨基酸由 精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),第96位由谷氨酰氨酸(Gln)变为精氨酸(Arg),E7蛋白的二级 结构及亲、疏水性也相应改变,与野生型有较大差异.
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口腔癌中人乳头瘤病毒16型和Ha-ras癌基因点突变的研究
目的检测口腔癌中的人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA和Ha-rar癌基因的点突变,探讨HPV16型和Ha-ras癌基因的点突变与口腔癌之间的关系.方法应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HPV16 DNA和Ha-ras癌基因相关片段,分别采用2%琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(RFLP),检测口腔癌中的HPV16 DNA和Ha-ras癌基因第12位密码子的点突变.结果在17例口腔癌组织中,6例(35.5%)组织HPV16 DNA阳性,5例(29.4%)组织Ha-ras癌基因发生点突变,其中2例组织HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性.结论口腔癌的发生可能与HPV16和Ha-ras癌基因的点突变有一定的关系.
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靶向IgA肾病Gd-B细胞HPV16 L1重组病毒样颗粒基因载体的构建与表达
目的:构建并表达靶向IgA肾病分泌糖基化缺陷IgA1分子B细胞(Gd-B)的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1重组蛋白病毒样颗粒(VLPs)基因载体.方法:PCR定点突变技术构建HPV16 L1-PH嵌合基因片段并与pPIC9K载体连接获得重组表达质粒;将上述质粒通过电转化形式转入毕赤酵母GS115,并在甲醇诱导下表达HPV16 L1-PH嵌合蛋白;对Ni柱纯化后获得的目的蛋白分别进行SDS-PAGE和LC-MS/MS鉴定;加入解组装及组装缓冲液对目的蛋白进行包装,透射电镜观察病毒样颗粒的结构及形态.结果:纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和LC-MS/MS鉴定确定所检测胶点中的蛋白质为与目的蛋白预测值相同.透射电镜分析粒径分布和结构与预测值相同.病毒样颗粒在组装及解组装缓冲液作用下通过电镜可观察到发生组装及解组装.结论:本研究成功获得了靶向IgA肾病患者异常Gd-B细胞的嵌合HPV16 L1-PH嵌合蛋白,为IgA肾病下一步实验研究与靶向性治疗奠定了基础.
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人乳头瘤病毒16型重组乳球菌疫苗的研制现状
人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus type 16，HPV16）是一类广泛感染人类上皮组织的小 DNA 病毒，能引起人体各种黏膜和皮肤的增生性疾病与肿瘤，与人宫颈癌的发生密切相关。疫苗接种是防治 HPV16感染的有效途径之一，现有疫苗的种类包括死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA 疫苗等，但存在一定的毒副作用，因此尚需研究新型 HPV16疫苗。
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高危HPV16E4基因的表达纯化及临床应用
目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16 E4重组表达体并表达纯化获得HPV16 E4重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16 E4血清抗体反应与宫颈癌的相关性.方法:将HPV16 E4基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E4表达重组体,转化大肠杆茵BL21(DE3)并用IPTG诱导表达.表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被酶联免疫吸附实验(ELISA)板,检测正常女性、慢性宫颈炎和宫颈癌患者血清抗体.结果:pRSET-16E4表达重组体的工程茵经IPTG诱导后可表达M15×103的HPV16 E4组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30%.表达形式为包涵体,重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实.80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者中,其血清抗体阳性率分别为10.00%,39.13%和28.13%,宫颈癌患者HPV16 E4血清抗体阳性率显著高于正常人,且慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率也显著高于正常人,但宫颈癌组HPV16 E4血清抗体阳性率与慢性宫颈炎组间的差异无统计学意义.结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16 E4融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌和慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率均明显高于正常人.
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人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达
目的 构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6,为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增E6基因.将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后,亚克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中;阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264.7巨噬细胞,Western blotting鉴定其在RAW264.7细胞中的表达.结果 重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误,转染RAW264.7细胞后可在细胞中表达HPV16 E6蛋白.结论 成功构建的HPV16 E6真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6能在RAW264.7细胞中表达E6蛋白.
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人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白真核栽体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础.方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达栽体peDNA3.1(+),双酶切及测序鉴定.将质粒pcDNA3.1(+)与peDNA3.1(+)/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达.结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1(+)相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E2;转染peDNA3.1(+)/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1(+)/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达.
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沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
目的 建立一种可准确、快速检测沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型3种病原体DNA的多重荧光定量PCR检测方法.方法 本研究针对沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型分别设计了一对特异性探针引物,构建了可同时检测沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型的多重荧光PCR反应体系,并与商业试剂同时检测300例临床标本,评估其一致性.结果 性能评价结果显示,所建立的多重荧光PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,与对照商业试剂检查结果符合率达到100％.结论 所建立的多重荧光PCR检测方法能实现3种病原体的快速、正确定量检测.
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人乳头瘤病毒16阳性与人乳头瘤病毒阴性食管癌的基因表达谱研究
目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染在食管癌的发生发展中可能存在的分子机制。方法采用PCR的方法检测食管癌患者中HPV的感染状况及型别,筛选出8例HPV 16阳性和7例HPV阴性的食管癌组织样本，进行Solexa测序及生物信息分析。结果HPV 16阳性患者中共筛选出796个差异基因，其中366个基因上调,430个基因下调。对差异基因进行功能分类和通路分析，发现这些差异基因主要涉及肿瘤发生、免疫和炎性反应、细胞生长增殖以及细胞运动等方面，其中以免疫炎性反应的因子具代表性。结论免疫因子的差异可能与食管癌中的HPV感染及作用存在一定关联。
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人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用
背景与目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切.本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡.方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况.结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P＜0.05).激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多.结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡.
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宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的表达纯化及血清抗体检测
背景与目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPV16)是宫颈癌组织中常见的高危HPV,其相应蛋白的血清抗体与宫颈癌的发生发展相关.本研究构建HPV16 E6重组表达载体并表达纯化获得HPV16 E6重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16 E6血清抗体反应与宫颈癌的相关性.方法:将HPV16 E6基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E6表达重组体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导表达.表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被ELISA板,检测正常女性、慢性宫颈炎患者和宫颈癌患者血清抗体.同时采用荧光偏振方法分型检测宫颈癌组织HPV DNA.结果:pRSET-16E6表达重组体的工程菌经IPTG诱导后可表达Mr 24×103的HPV16 E6组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的22.3%.表达形式为包涵体,重组蛋白纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实.80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者血清抗体阳性率分别为5.0%、6.5%和31.2%,宫颈癌患者HPV16 E6血清抗体阳性率显著高于正常人(P＜0.002)及慢性宫颈炎患者(P＜0.01),而正常人与慢性宫颈炎患者间的差异无显著性.32例宫颈癌患者癌组织中,HPV DNA阳性率90.6%,HPV16 DNA阳性率46.9%.HPV16 DNA阳性组血清HPV16 E6抗体阳性率(46.7%)高于阴性组(17.6%),但两组间的差异无显著性(P＞0.05).结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16 E6融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌患者HPV16 E6血清抗体阳性率明显高于正常人和慢性宫颈炎患者.
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广东地区HPV16型L1基因的序列分析及其毕赤酵母表达载体的构建
目的: 分析广东地区人乳头瘤病毒(HPV)16型L1基因结构特点;构建广东分离株HPV16 L1毕赤酵母分泌型表达载体.方法:采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV16 L1基因,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαC,测序并对HPV16 L1基因进行序列分析.结果:成功扩增了广东地区HPV16 L1基因,并构建了其毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1.广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株相比有16处不同,同源性为98.99%,其编码的氨基酸序列有8处发生改变;与中国标准株比较有9处不同,同源性为99.18%,其编码的氨基酸序列有4处发生变化;发现在HPV16 L1基因序列中nt5 649、nt5 652、nt5 654、nt5 657、nt5 692、nt5 693,6个位点存在突变.结论:广东地区HPV16 L1基因序列与德国标准株、中国标准株相比较均存在差异;成功构建广东地区HPV16 L1真核表达载体.
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HPV16阳性和阴性患者宫颈癌组织中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表达差异及其机制研究
目的:探讨miR-27a-3p和同源盒B8(HOXB8)蛋白在人乳头瘤病毒16型阳性[HPV16(+)]和阴性[HPV16(-)]患者宫颈癌组织中表达的差异及其机制.方法:选取2012年1月-2016年1月于我院就诊的宫颈癌患者120例,根据其是否感染HPV16分为HPV16(+)组(60例)和HPV16(-)组(60例).采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表达水平,采用蛋白印迹法检测HOXB8蛋白的表达水平,采用巢式降落式甲基化特异性聚合酶链反应法检测miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平,采用染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链反应法检测miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平;培养人宫颈癌细胞系SiHa细胞株,考察转染miR-27a-3p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)后miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表达水平.结果:HPV16(+)组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p的表达水平显著低于HPV16(-)组患者,HOXB8 mRNA和蛋白表达水平、miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平和组蛋白甲基化水平均显著高于HPV16(-)组患者,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).在SiHa细胞转染miR-27a-3p mimic后,miR-27a-3p的表达水平显著升高,而HOXB8 mRNA的表达水平显著降低;转染miR-27a-3p inhibitor后,miR-27a-3p的表达水平显著降低,而HOXB8 mRNA的表达水平则显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01).结论:HPV16可能通过启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化下调miR-27a-3p的表达,从而影响宫颈癌的发生与发展,HOXB8蛋白可能是其作用靶点.
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HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达
目的 构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定.方法 采用PCR 技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3 融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL.经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达.结果 经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功.结论 构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础.
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人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a(+),获得pET28a(+)-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.
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利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性
目的 建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究.方法 建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证.结果 ZsGreen法的HPV16/18假病毒佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性.结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究.
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人乳头瘤病毒多肽与人免疫球蛋白G融合表达
目的将人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV-16)的晚期表达蛋白E7上的抗原24肽(从第38位氨基酸到第61位氨基酸)与人免疫球蛋白G的重链恒定区融合表达,并以此融合蛋白作为抗原,可能为HPV-16病毒感染防治提供免疫治疗方法.方法利用PCR方法分别扩增HPV-16 E7(38-61)24肽的DNA片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区DNA片段,并构建到pET21a表达载体上,转化入E.coli中表达,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western-blotting)的方法对表达结果进行鉴定.结果构建的表达载体HPV16E7e/hIgGHCCR-pET21a经酶切鉴定和测序显示序列正确;通过SDS-PAGE和Western-blotting的鉴定,重组融合蛋白Mr约40 000,表达量可占菌体蛋白的20%左右.结论成功构建HPV16-E7的抗原多肽片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区的融合蛋白,并可在E.coli中高效表达.
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原核表达系统中 HPV16 L1蛋白的表达与纯化
为了建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法,纯化目的蛋白,我们构建了pGEX4T-HPV16L1表达质粒.在大肠杆菌BL21表达系统中表达,经过包涵体提取,8M尿素溶解, 分级透析除去尿素,亲和层析进行提纯.结果显示,HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在,通过本方法可以获得纯化的HPV16L1蛋白,为HPV16L1的应用研究打下了基础.
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大肠癌HPV16感染和PCNA的关系及预后价值
目的探讨大肠癌HPV16感染和PCNA的关系及其预后价值.方法应用免疫组化的方法检测50例大肠癌HPV16L1、PCNA的表达情况,并结合临床随访和病理学资料评估其相互关系和预后价值.结果大肠癌不同病理分期或分化程度之间,PCNA标记指数(PCNA labelljng jndices,PCNA-LI)均有显著差异;大肠癌HPV16L1阳性表达率为46%(23/50),HPV16L1阳性者PCNA-LI明显高于HPV16L1阴性者,并且其生存率降低.结论PCNA和HPV16L1可作为评价大肠癌预后的参考指标.
