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人乳头瘤病毒16型E5蛋白功能的研究进展
人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白具有特殊的生物学活性,在宫颈癌发生过程中起重要作用.HPV16 E5蛋白具有转化活性,并可增强E6和E7蛋白的致癌活性.E5蛋白的转化活性主要通过上皮生长因子受体(EGFR)信号上调发挥作用.近年来还发现,HPV16 E5蛋白是影响免疫系统和炎症通路的关键因子,可能成为宫颈癌治疗的一个靶标.本文就HPV16 E5蛋白当前的研究进展进行综述.
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HPV-16 URR突变对病毒早期启动子活性影响的研究
背景与目的:新疆是宫颈癌高发区,该地区宫颈癌高发与人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPV-16)感染密切相关.该研究旨在分析新疆地区妇女宫颈病样组织中HPV-16上游调控区(upstream regulatory region,URR)的突变及其功能.方法:以新疆妇女子宫颈上皮非典型增生(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌病样组织标本DNA为模板,PCR扩增HPV-16URR片段,PCR产物经测序比对,筛选代表性的URR突变体构建至pGL3-Basic载体,将其转染Vero细胞,48 h后检测荧光素酶活性,分析URR突变体启动子活性.结果:采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得了55个HPV-16URR DNA片段,测序及序列分析发现44个突变位点,其中nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4个位点的突变为所有序列共有,nt7520(G→A)位点的突变存在于54个样品中,剩余39个位点的突变存在于不同样品中.根据突变的位置、频率和程度,筛选出9个URR突变体分别克隆至pGL3-Basic中荧光素酶基因前并转染Vero细胞.荧光素酶活性分析表明,不同URR突变体的启动子活性差异较大,来源于宫颈癌的URR突变体启动子活性显著高于来源于CIN的URR突变体(P<0.01),部分宫颈癌URR突变体的启动子活性显著高于SiHa和Caski细胞来源的URR参照序列的启动子活性.结论:新疆地区分离的HPV-16 URR发生多位点突变,其中部分突变增强了URR内部启动子的活性,导致HPV-16致癌活性增强.
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HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的研究
目的:研究治疗性HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的抗肿瘤活性.方法:通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的体内治疗作用和对小鼠生存期的影响.结果:重组蛋白疫苗免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞与该疫苗体外混合培养增殖明显,并可特异性地在体外杀伤TC-1细胞;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有显著的抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应;显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.
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HPV16E6/E7融合蛋白疫苗与放疗联合应用治疗宫颈癌的实验研究
目的: 观察人乳头瘤病毒16型(HPV)E6/E7融合蛋白疫苗与放疗(12 Gy)联合应用对宫颈癌的治疗效果.方法:24只雌性C57BL/6小鼠右侧后肢接种肿瘤细胞后7 d,随机分为4组:对照组(C,n=6);免疫组(IM,n=6);放疗组(RA,n=6);联合治疗组(IM+RA,n=6).比较各组小鼠的肿瘤生长速度及存活时间.采用TUNEL法对小鼠肿瘤组织中细胞的凋亡情况进行检测.结果: IM+RA组小鼠肿瘤生长速度较慢,平均存活时间明显长于RA、IM及C组,IM组与C组动物的平均存活时间没有差异.TUNEL实验结果表明,IM+RA组小鼠肿瘤组织中凋亡细胞明显高于其他各组.结论: HPV16E6/E7融合蛋白疫苗与放疗联合应用,具有协同抗肿瘤作用.
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HPV16病毒中国山西襄垣流行株基因HPV16Z的序列分析
目的:分析中国山西襄垣地区人乳头瘤病毒16型HPV16Z基因的结构特点.方法:对HPV16Z进行双向测序,并将其基因全序列与德国标准株进行对比分析.结果:DNA序列分析表明,HPV16Z与已发表的德国标准株基因长度相等,其中LCR和L1、E6部位的核酸片段存在变异.LCR的变异部位分别位于7431～7432 nt、7433 nt、7495 nt、7852 nt,变异方式分别为碱基插入、碱基替代及碱基缺失突变;L1的变异部位分别位于6169～6171 nt、6901～6902 nt、6949～6951 nt,其变异方式为碱基替代、碱基插入及碱基缺失突变;E6的变异部位位于350 nt,其变异方式为碱基替代突变.结论:中国山西襄垣地区妇女宫颈癌患者组织中HPV16型病毒HPV16Z基因结构与德国标准株HPV16基因之间存在一定的差异.
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HPV16型E7蛋白在喉癌组织中的表达
Syrjanen[1]首次提出人乳头瘤病毒(HPV)感染与喉癌有关,但其致癌机制还不完全清楚.我们用免疫组化方法检测了42例喉癌组织及26例声带息肉中的HPV16型E7蛋白表达,探讨其在喉癌发病过程中的生物学意义,为喉癌的防治提供依据.
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人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用
目的 建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗(HPV16 L2E6E7)酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控.方法 用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性.结果 建立了检测HPVI6 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53～1 250 ng·mL-1内有很好的线性(R2＞0.99)和回收率(90％～110％);特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰.结论 建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段.
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新疆妇女子宫颈病变组织中HPV16E6基因突变分析
目的 通过检测HPV16E6基因突变在新疆维吾尔族和汉族妇女宫颈癌组织中的分布规律,以探讨该突变与宫颈癌发生的关系.方法 取汉族宫颈炎(含石蜡包埋组织及宫颈刷液基标本)125例,维吾尔族宫颈炎(含石蜡包埋组织及宫颈刷液基标本)124例;汉族石蜡包埋宫颈癌35例,维吾尔族石蜡包埋宫颈癌共109例.用以上HPV16阳性DNA模板PCR扩增HPV16E6全长基因,PCR产物直接测序,分析新疆女宫颈癌组织HPV16E6基因的突变.结果 PCR检测结果显示汉族族宫颈炎组织中HPV16E6阳性率为35.71%(15/42);维吾尔族宫颈炎组织中HPV16E6阳性率为30.46%(14/46);汉族族宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为33.33%(2/6),维吾尔族宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为22.22%(12/54);宫颈炎与宫颈癌中HPV16E6阳性表达无统计学意义(P>0.05),对21份(上皮内低度病变1例,原位癌1例,低分化宫颈癌4例,中分化宫颈癌4例,高分化1例,轻度炎症4例,中度炎症3例,重度炎症1例,正常宫颈2例)HPV16E6扩增片段的双向测序,其中5例成功测序得到一级结构,并且序列分析表明,2例(维吾尔族宫颈癌低分化1例,中分化1例)其E6基因与原型相同,3例(汉族轻度炎症1例,汉族宫颈癌中分化1例, 上皮内低度病变1例)其发生了L83V突变.结论 中国新疆HPV16E6基因发生变异,其原型和变异型在该地区汉族、维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中的分布可能与该地区宫颈癌高发存在一定的联系.
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实时PCR快速检测宫颈组织HPV16感染的应用
目的建立实时PCR技术快速检测宫颈组织HPV16感染.方法根据Gene Bank中HPV16E6序列,设计合成特异的引物和MGB荧光探针,优化实验条件,并对40例宫颈癌,38例宫颈非典型增生,20例正常对照宫颈组织标本进行HPV16 DNA检测.结果建立了灵敏、特异地检测宫颈组织HPV16 DNA的实时PCR技术;宫颈癌、宫颈非典型增生和正常对照宫颈组织中HPV16 DNA阳性率分别为42.5%、34.2%和0%;宫颈癌组织中HPV16 DNA平均拷贝数(106.01±1.22拷贝/mL)高于宫颈非典型增生组(105.78±1.37拷贝/ml),但差异无显著性(P＞0.05).结论实时PCR检测宫颈组织内HPV16感染,具有快速、简便、特异性强等优点,适用于临床常规检测.
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人β防御素-2联合HPV16E7c免疫小鼠的免疫学效应实验研究
目的 探讨以人β防御素-2为佐剂的HPV16 E7c免疫功能及细胞免疫应答.方法 将30只小鼠按随机数字表法分为3组:PBS组、pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组,每组10只.PBS组采用PBS 100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pcDNA3.1(+)/E7c组采用pcDNA3.1(+)/E7c质粒100 μg·只-1 行股四头肌肌内注射,进行初次免疫;pEGFP-C1/HBD2-E7c组采用pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒100 μg·只-1行股四头肌肌内注射,进行初次免疫.3组初次免疫后,再间隔2周,以上述方法和剂量加强免疫2次.共免疫3次.3组小鼠免疫1周后,断颈处死小鼠,取小鼠脾脏称重,计算脾脏脏器指数及计数脾淋巴细胞数量,流式细胞仪检测淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值;采用摘眼球采血法收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠血清E7抗体水平.结果 pcDNA3.1(+)/E7c组、pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠脾脏脏器指数均明显低于PBS组(均P＜0.01).pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+、CD8+阳性细胞比例、绝对数均明显高于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠CD4+/CD8+比值均明显低于PBS组(均P＜0.05),pEGFP-C1/HBD2-E7c组、pcDNA3.1(+)/E7c组小鼠血清E7抗体水平均明显高于PBS组(均P＜0.01),pEGFP-C1/HBD2-E7c组小鼠血清E7抗体水平明显高于pcDNA3.1(+)/E7c组(P＜0.05).结论 人β防御素-2可明显改善HPV16 E7c基因的免疫原性,提高HPV16E7特异性抗体水平,升高免疫小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞数量.
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青岛地区不同宫颈病变组织中HPV16E2基因突变分析
目的:探讨山东省青岛地区不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2基因序列多态性,以及序列变异与不同宫颈病变的关系.方法:提取257例宫颈脱落细胞及宫颈癌组织DNA,PCR进行HPV分型,其中HPV16阳性标本扩增E2基因,测定PCR产物序列.通过DNAStar生物软件进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果:共检测出11个碱基突变位点,其中10个导致氨基酸的改变,突变热点为nt3410(63.2％),nt3159(55.9％),nt3249 (55.9％).统计学分析显示,各个位点的突变与不同级别宫颈病变之间均无相关性(P＞0.05).宫颈癌标本中基因整合率为[65％(14/40)],远高于CINⅢ的整合率[14％ (6/43)] (P＜0.001).结论:青岛地区HPV16 E2基因存在多个位点的突变,且发现G2828A,T3274G,T3384C,T3524C为青岛地区特异性突变,这些位点的突变可能与高度上皮内瘤变和浸润性宫颈癌的发生和发展有关.
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青岛地区宫颈病变组织中HPV16 URR和E6基因突变分析
目的:分析青岛地区妇女不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)和E6基因序列多态性,以及序列变异与宫颈病变的相关性.方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术检测120例宫颈癌及254例宫颈上皮内瘤变(CIN)标本,筛选出HPV16阳性标本,进而扩增出HPV16 URR和E6基因,PCR产物纯化后测序,与德国HPV标准株进行对比分析.结果:URR测序结果发现了19个突变位点,所有标本在7521位点均发生了G→A突变;63.30%(69/109)标本中检测到24,7730和7842的联合突变,为另一突变热点.E6测序结果共发现17个突变位点,突变热点为178位点(D25E),其在宫颈癌组、CINⅢ组和CINⅡ组的比例分别为61.11%(44/72)、62.00%(31/50)和50.00%(16/32),3组的差异无统计学意义(P=0.499).仅观察到6例350位点突变(L83V).亚洲型(AS)是多见的突变类型,在154例HPV16阳性标本中占59.09%,其次为E-P原型(33.12%).结论:青岛地区妇女宫颈病变组织中HPV16URR突变热点为nt7521以及nt24、nt7730和nt7842的联合突变.HPV16 E6突变热点为nt178,这些突变热点可能与癌前病变的进展有密切关系.AS型和原型是青岛地区宫颈病变组织中两种主要的HPV16分支.
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外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响
目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用.方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞.采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异.结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P＜0.01).结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件.
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扬州地方株HPV16 E7基因的克隆及序列分析
目的:了解扬州地区HPV16E7基因结构特点.方法:从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16E7基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-E7,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析.结果:扬州地方株HPV16E7基因与已报道的标准株(德国)仅在核苷酸序列上有一处突变,即199位的T→C,密码子由TTG变为CTG,而氨基酸序列未发生改变;与其他国家报道的HPV16E7核苷酸序列也存在一定差异,但同源性均在98.7%以上.结论:扬州地方株HPV16E7基因的成功克隆,将丰富我国HPV16感染的流行病学资料,为HPV疫苗研制奠定基础.
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人乳头瘤病毒16型L1基因乳酸杆菌表达载体的构建
目的:构建含人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的乳酸杆菌分泌表达载体.方法:从培养的CasKi细胞中提取DNA为模板,经PCR得到HPV16 L1衣壳蛋白基因,将其连接入乳酸杆菌分泌表达载体pVE5523质粒中,并转化入Top10菌中保存.结果:构建的HPV16 L1-pVE5523重组表达载体经PCR鉴定正确;获得的目的基因片段经测序与GenBank公布的HPV16 L1基因序列符合.结论:成功构建了HPV16 L1-pVE5523表达载体.
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HPV16 E7蛋白阳性和阴性乳癌组织中P16蛋白与p16基因启动子区甲基化检测
率高于HPV16E7-乳癌组织(X2=20.525,P<0.01).结论:HPV16 E7蛋白可能通过降低p16基因的甲基化使P16蛋白表达水平升高,从而在乳癌的发生、发展过程中发挥重要作用.
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HPV16 E7蛋白阳性和阴性乳癌组织中Rb和P16蛋白的表达
6/42)、21.4%(3/14),HPV16 E+和E7-乳癌组织中P16和Rb蛋白阳性率差异均有统计学意义(X2=20.525,10.898,P均<0.001).HPV16 E7+乳癌组织中,Rb和P16蛋白表达有关(rP=0.792,P=0.003);HPV16 E7-乳癌组织中,Rb和P16蛋白表达无关(P=0.182).结论:HPV16 E7可通过降解Rb,促进P16蛋白表达,从而在乳癌发生发展中发挥作用.
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HPV16 DNA阳性乳腺良、恶性病变组织中E6和E7蛋白的表达
重要作用,并与乳癌淋巴结转移有关.
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HPV16 E6蛋白阳性和阴性乳癌组织中p53基因检测
.结论:HPV16 E6+乳癌组织中基因突变不是p53灭活的主要机制,而E6-乳癌组织中p53灭活的主要方式是基因突变;HPV16 E6可通过降解wtP53蛋白而在乳癌发生发展中发挥作用.
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HPV16 E7蛋白阳性和阴性乳癌组织中细胞周期调控相关基因蛋白的表达
9,P均<0.01),P21表达下调(X2=10.898,P<0.01),而Cyclin D和P27的表达均无明显变化(X2分别为0.033,0.025,P均>0.05).结论:HPV16 E7可通过统计量上调Cyclin A和Cyclin E表达以及下调P21表达而在乳癌发生发展中发挥重要作用.
