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人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备
目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.
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宫颈癌中HPV16 E5基因的变异与病毒物理状态的研究
目的研究HPV16 DNA在宫颈癌组织中的物理状态及其与E5转化基因的变异的关系.方法用斑点杂交方法确定HPV16阳性的宫颈癌标本,采用Southern 印记杂交技术检测HPV16 DNA在宫颈癌组织中的物理状态,并结合E5基因的扩增及序列测定来综合探求HPV16基因组在宿主细胞中的物理状态及其与E5 片段变异的关系.结果 60例宫颈癌组织中HPV16阳性率为58%(35/60);其中有22%(8/35)的HPV16 DNA是以游离状态存在于宿主细胞内.在HPV16以游离型存在的宫颈癌标本中,仅有1例(1/8)发生了变异.结论不同病理分期的宫颈癌组织 HPV16的物理状态无明显差异.在游离型HPV16致癌机制中,E5的变异似乎不占主导地位.所得结果为揭示HPV16致宫颈癌的分子机制尤其是为E5在游离型HPV16致癌机制提供了新资料.
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鲍温样丘疹病的临床及感染人乳头瘤病毒类型的研究
目的研究鲍温样丘疹病(BP)的诊治及其感染人乳头瘤病毒(HPV)的类型.方法对9例BP的临床表现、组织病理及治疗进行总结,用PCR法检测13例BP石蜡组织标本HPV16 L1基因.结果BP表现为生殖器部位的褐色扁平丘疹,有线状排列趋势.病理表现为角化不全,棘层肥厚,角质形成细胞出现异型性并排列如伏麦状,基底膜完整.8例经疣体破坏、干扰素及免疫增强剂治疗,全部治愈;1例行手术局部扩大切除后复发,再经上述方案治疗而愈.13例BP标本有12例HPV阳性,都为HPV16.结论BP主要由HPV16感染引起,临床和病理表现特异,疣体破坏结合干扰素及免疫增强剂治疗,疗效较好.
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宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析
目的分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型(HPV16型)E6基因的结构特点.方法采用PCR技术扩增了1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16 E6基因,并对其进行了克隆及全序列分析. 结果成功地克隆了HPV16 E6基因,与GenBank收录的原型相比,E6基因中有2个碱基发生突变,推导其编码的氨基酸有1个发生了变化.结论中国人宫颈癌HPV16 E6基因结构有一定的变异.
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人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16) E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性.方法 人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因.将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白.纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价.结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致.表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符.以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000.结论 成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性.
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Caski 细胞内 Daxx 与 HPV16 E2蛋白的结合作用
目的：研究人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白在 Caski 细胞内与 Daxx 的相互作用，探讨它们在 HPV16所致宫颈癌发生发展中的作用。方法利用间接免疫荧光染色技术观察 HPV16 E2和 Daxx 在 Caski 细胞中的分布或共定位；通过免疫共沉淀试验和免疫印迹分析 HPV16 E2与 Daxx 在 Caski 细胞内的相互作用。结果在 Caski 细胞内，Daxx 和 HPV16 E2主要分布于胞浆，少数分布于胞核，且两种信号在细胞浆内有一定的共存；抗 E2抗体能沉淀Daxx，反之抗 Daxx 抗体同样能够沉淀 HPV16 E2。结论HPV16 E2与 Daxx 在 Caski 细胞存在直接的相互作用。
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新疆哈萨克族食管癌组织中乳头瘤病毒16型E6E7基因的研究
为了解HPV16感染后E6E7基因变化在哈萨克族食管癌发病中的作用,以及HPV16E6E7基因与食管癌病理组织分级的关系,采用聚合酶链(PCR)技术,检测82例食管癌及癌旁正常食管粘膜组织中HPV 16E6E7基因差别.食管癌、癌旁正常粘膜组HPV16E6 E7基因的检出率分别为34.15%(14/41)和19.51%(8/41),63.41%(26/41)和48.78%(20/41),差别均无显著性(P＞0.05).然而,在食管癌组织的高分化组、中低分化组中HPV16E6E7的检出率分别为7.69%(1/13)和46.43%(13/28),38.46%(5/13)和75%(21/28),差别均有统计学意义(P＜0.05).提示HPV16E6E7基因与哈萨克族食管癌的发生及癌组织分级密切相关.
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新疆哈萨克族食管癌患者HPV16 E6基因的克隆及序列分析
目的:分析新疆地区哈萨克族食管癌患者人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6基因结构的特点.方法:采用PCR技术扩增食管癌患者HPV16 E6基因,其中18例哈萨克族食管癌中8例阳性,阳性率为44.4%,并对其进行了克隆及全序列分析.结果:克隆了哈萨克族食管癌HPV16 E6基因,与Genebank(AF536179.1)收录的德国株相比,E6基因中氨基酸发生了变化.结论:新疆哈萨克族食管癌HPV16E6基因有一定的变异.
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雌激素及其受体与IL-17在HPV16持续感染阶段的表达研究
目的 探讨雌激素、雌激素受体及白介素-17(IL-17)在人乳头瘤病毒(HPV)感染与清除过程中的作用.方法 选取上海市浦东新区人民医院2014年8月至2017年1月门诊或住院部宫颈细胞学正常、HPV阴性或单一人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性的患者,采用宫颈TCT对所有研究对象进行细胞学检测,反向斑点杂交技术进行HPV亚型分析及实时荧光PCR进行HPV16 DNA定量;用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清中雌激素(E2)水平及宫颈灌洗液中IL-17浓度,免疫组化检测雌激素受体(ER)表达水平.上述实验每3个月重复一次.按照HPV16感染结局的不同,将实验分为HPV阴性组、HPV16清除组和HPV16持续感染组.结果 将所有研究对象后一次检查结果与第一次检查结果对比发现,HPV阴性组、HPV16清除组及HPV16持续感染组之间E2比较,差异无统计学意义(P＞0.05),ER在各组之间的差异也不明显,差异均无统计学意义(P＞0.05).IL-17表达浓度差在HPV阴性组与HPV16持续感染组间差异无统计学意义,二者与HPV16清除组之间IL-17浓度差异显著,HPV16清除组中IL-17浓度明显增高.结论 在细胞学正常,而仅为HPV16感染阶段,内源性E2及宫颈局部组织中的ER可能并没有发挥作用,抑或E2或ER对HPV感染影响不大,而局部免疫因子IL-17在HPV16清除过程中发挥了重要作用,IL-17浓度的增加有利于HPV16的清除.
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毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度
目的:建立毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度.方法:采用50 μm×57 cm(有效长度50cm)无涂层毛细管.进样时方法设置为:进样5 kV,20 s;分离电压为15 kV,维持30 min,两端加压138 kPa;温度:25 ℃;检测波长:220 nm.结果:毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒(HPV) 16型、18型原液主峰分离度分别为2.4和3.0,HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.125 ～0.750 mg·mL-1时线性关系良好(HPV 16L1,r =0.9836;HPV 18L1,r =0.9931).HPV 16L1和HPV 18L1原液的精密度和稳定性试验的RSD均＜2.0％.结论:本文建立的方法可用于重组人乳头瘤病毒原液的纯度检测.
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Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数
目的:建立Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数.方法:分别将HPV 16·V5中和单抗与HPV 18·J4中和单抗偶联到CM5芯片上,然后根据Biacore X-100 Kinetics/Affinity控制软件将HPV 16L1和HPV18L1原液分别稀释至适当的不同浓度,采用50 mmol·L-1氢氧化钠溶液作为再生液进行动力学分析.根据Biacore X-100Evaluation分析软件进行拟合,得到样品的动力学常数KD值.结果:Biacore法测定重组人乳头瘤病毒16型、18型原液动力学常数KD分别为4.844 × 10-10 mol·L-1和1.67 × 10-10 mol·L-1,HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.625～40 μg· mL-1时线性关系良好(HPV16L1:Y=17.77X-0.0184,r=1.000;HPV 18L1:Y=18.73X+5.282,r=0.9957).HPV 16L1和HPV18L1原液精密度和稳定性试验的RSD均＜20％.并且Biacore法测定的结合常数ka值和体外相对效力测定(IVRP法)的EC50值之间具有一定的相关性.结论:该方法实时、简便、快速、准确、灵敏,适用于重组人乳头瘤病毒原液的动力学分析.
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NF-κB、COX-2在宫颈癌组织中的表达及其与HPV16感染的关系
背景与目的:探讨宫颈癌组织中NF-κB、COX-2的表达及其与HPV16感染的关系.材料与方法:采用免疫组织化学PowerVision TM二步法对46例宫颈癌和31例正常宫颈组织进行NF-κB、COX-2蛋白检测,用PCR技术对组织标本的HPV16 DNA进行检测.结果:NF-κB、COX-2在宫颈癌组织中的表达率显著高于正常对照组(P＜0.01),NF-κB、COX-2的表达与HPV16型的感染具有相关性(P＜0.05).结论:宫颈癌组织中NF-κB、COX-2呈高表达.NF-κB的活化及COX-2的高表达可能与HPV16感染有关.
