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湖北恩施地区土家族人群RAF-1 rs1051208基因多态性与胃癌易感性的关系
目的:探讨RAF-1 rs1051208基因多态性与胃癌易感性的关系.方法:收治接受胃大部切除或者胃全切手术的胃癌患者60例,同期收集健康体检者60例为对照.采用SNaPshot方法对分离的DNA进行基因分型.结果:RAF-1 rs1051208 SNP基因型在两组之间的分布差异有统计学意义(P<0.05).结论:RAF1基因C等位基因在胃癌易感性中起重要作用,因此,SNPs是预测可怕疾病尤其是癌症易感性的重要生物标志物之一.
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Raf-1基因可能与口腔上皮癌细胞多药耐药性发生机制有关
目的 通过检测Raf-1基因在口腔上皮癌多药耐药细胞株(KBV)及敏感细胞株(KB)中表达的差异,探讨Raf-1基因在口腔上皮癌细胞多药耐药性发生中的作用. 方法 体外培养口腔上皮癌多药耐药株及敏感株,通过RT-PCR技术及免疫荧光技术、免疫印迹技术检测Raf-1基因在KB及KBV细胞中转录及翻译水平的差异,通过MTT法及流式细胞检测技术(FCM)检测KB及KBV细胞对长春新碱(VCR)敏感度的差异.结果 KB组细胞株在Raf-1基因转录和翻译水平均非常显著地低于KBV组(P<0.01);MTT法检测结果显示,KBV组细胞对长春新碱的耐药性是KB组的16.5倍;流式细胞术检测结果显示,KB组细胞凋亡率显著高于KBV组(P<0.01).结论Raf-1基因可能参与口腔上皮癌耐药性的发生过程,成为引起肿瘤细胞耐药的重要原因之一.
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乳腺癌 Raf-1和 Ki67表达及新辅助化疗前后变化研究
目的探讨Raf-1和Ki67在乳腺癌表达水平与临床病理特征相关性，并研究其在新辅助化疗前后的变化。方法采用免疫组织化学方法（ SP法）检测186例乳腺癌病理组织中的Raf-1和Ki67的阳性表达情况，其中包括68例新辅助化疗前后的组织标本。结果乳腺癌组织中Raf-1和Ki67的表达与淋巴结有无转移和病理分期、临床分期等有关（ P＜0.001）；新辅助化疗后Raf-1和Ki67的阳性表达较新辅助化疗前均有所下降，差异有统计学意义（ P＜0.001）；Raf-1和Ki67在新辅助化疗前后的表达变化值与化疗疗效明显相关（ P＜0.001），新辅助化疗效果越好，Raf-1蛋白和Ki67下降越明显。结论 Raf-1和Ki67阳性表达与乳腺癌的发生发展具有密切的相关性。新辅助化疗影响Raf-1和Ki67的表达，新辅助化疗后应重新检测Raf-1和Ki67的表达，为后续治疗及判断预后提供指导。
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Raf-1在肝细胞肝癌组织的表达
目的:探讨Raf-1在肝细胞肝癌组织中表达的临床意义、相关性及对预后的影响.方法:应用免疫组织化学方法检测50例肝细胞肝癌组织、17例癌旁硬化肝组织及14例正常肝组织Raf-1的表达. 分析其与临床特征的关系.结果:Ra f-1在肝细胞肝癌组织中的表达显著高于癌旁硬化肝组织和正常肝组织( Z =-5.079, Z = -5.082, 均P = 0.000). Raf-1表达与临床分期、病理分级、年龄、肿瘤大小、癌栓明显相关( r = -0.452, -0.547, 0.301, -0.357,-0.464, 均P<0.05). Raf-1表达(-)-(+)者平均生存时间较短, 生存率较低, 预后较差;Raf-1表达(++)-(+++)者平均生存时间较长, 生存率较高, 预后较好.结论:Raf-1在肝细胞肝癌组织中的表达显著升高. 对伴有癌栓、肿瘤较大且分化较差、属临床分期较晚的青壮年肝癌患者, Raf-1阳性表达较弱, 生存期较短, 预后较差.
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Raf-1基因重组腺病毒 siRNA 载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响
目的：构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体，并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列，经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中获得pAdTrack-siRaf-1质粒，PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siRaf-1质粒，后转染HEK293细胞，包装获得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒，继而感染原代培养的心肌细胞，通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液体闪烁计数仪测定3 H-亮氨酸（[3 H]-leu）掺入率，用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确，制备的病毒感染效率高，携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3 H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。
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重组小鼠Raf-1蛋白在大肠杆菌中表达的实验研究
目的:表达小鼠重组Raf-1蛋白,为进一步研究其在信号传导中的功能奠定基础.方法:提取小鼠肝脏组织总RNA,逆转录合成cDNA,巢式PCR扩增Raf-1基因编码区.将Raf-1基因克隆入原核表达载体pETDuet-1,IPTG诱导表达,表达产物行Western Blot鉴定.结果:经SDS-PAGE及Western Blot证实,在大肠杆菌中有重组鼠Raf-1的表达,表达产物主要存在于包涵体中.结论:实现了重组小鼠Raf-1的表达.
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榄香烯抑制Raf/MEK/ERK信号通路诱导人源胶质瘤U87细胞凋亡
目的 探讨莪术提取物榄香烯体外诱导胶质瘤细胞凋亡的机制.方法 采用流式细胞术、Western印迹等方法,分别检测不同浓度榄香烯对人源U87胶质瘤细胞的凋亡诱导及其对U87细胞Raf-1、ERK、癌基因Bcl-2蛋白质表达的影响.结果 榄香烯对人源U87胶质瘤细胞具有明显的凋亡诱导作用,该增殖抑制效应呈时间依赖性.榄香烯可明显下调U87细胞的磷酸化Raf-1、ERK、Bcl-2表达.结论 体外榄香烯对胶质瘤细胞具有明显的凋亡诱导作用(呈时间依赖性),抑制Raf/MEK/ERK信号通路,从而下调其下游信号癌基因Bcl-2的表达,终启动凋亡程序可能是榄香烯诱导U87细胞凋亡的机制.
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榄香烯阻碍大鼠胶质瘤C6细胞ERK信号通路中Hsp90/Raf-1分子复合体的形成
目的 探讨莪术提取物榄香烯抑制胶质瘤细胞体外增殖的机制.方法 采用细胞计数、免疫共沉淀、Western印迹等方法,分别检测不同浓度、不同作用时间榄香烯对C6胶质瘤细胞的增殖影响、对C6细胞中与Raf-1结合形成分子复合体的Hsp90水平的影响、对C6细胞Hsp90、Raf-1、ERK蛋白质表达的影响.结果 榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的抑制增殖作用,该增殖抑制效应呈剂量、时间依赖性.榄香烯可明显下调C6细胞中与Raf-1结合的Hsp90水平及C6细胞的磷酸化Raf-1、ERK表达,但不影响总Hsp90的表达水平.结论 榄香烯能有效抑制胶质瘤细胞的体外增殖,破坏Hsp90的分子伴侣功能,阻碍Hsp90/Raf-1复合体的形成,使Raf-1不能被活化,终下调胶质瘤细胞赖以生存的Raf/MEK/ERK通路,这可能是榄香烯抑制C6细胞增殖的机制.
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14-3-3／Raf-1复合体介导的榄香烯抗胶质瘤作用
目的：探讨莪术提取物榄香烯在体外抗胶质瘤作用及相关机制。方法采用细胞计数、免疫共沉淀、Western印迹等方法分别检测经不同浓度、不同作用时间榄香烯对U87胶质瘤细胞的增殖影响、对U87细胞中与Raf-1结合形成分子复合体的14-3-3表达水平的影响、对U87细胞14-3-3、Raf-1、ERK蛋白质表达的影响。结果榄香烯在体外具有浓度、时间依赖的抗胶质瘤效应，其IC50约为（83．2±4．3）μg/mL。分子机制研究表明：榄香烯对总14-3-3蛋白表达无明显影响（ P＞0．05），能明显抑制14-3-3/Raf-1复合体的形成；榄香烯明显下调ERK-1/2信号通路中关键蛋白P-Raf -1、P-ERK-1/2的表达（P＜0．05），对非磷酸化的ERK-1/2和Raf-1无明显影响（P＞0．05）。结论榄香烯在体外通过破坏14-3-3的分子伴侣功能，阻碍14-3-3/Raf-1复合体的形成，使Raf-1不能被活化，进一步抑制Raf/MEK/ERK通路，达到抗胶质瘤细胞作用。
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人结肠癌组织中Raf-1的表达及其临床意义
目的:研究Raf-1在人结肠癌组织中的表达与肿瘤血管生成的关系,并探讨它们的临床意义.方法:应用组织芯片技术和免疫组化法检测来自西京医院病理科2005-2006年间的87例结肠癌病例癌区、癌旁区及切缘区组织标本中Raf-1的表达,应用CD34标记的免疫组化法检测微血管密度(microvessel density,MVD);并分析Raf-1表达和MVD与结肠癌体积、转移、分化等病理特征之间的相关性.结果:Raf-1在癌组织、癌旁组织、切缘区组织的阳性率分别为86.47%、37.34%和11.03%,3者比较有显著性差异(P<0.01).癌组织、癌旁组织、切缘区组织中MVD值分别为(61.35±11.60)、(28.34±6.70)和(8.26±3.70),3者有显著性差异(P<0.01).Raf-1表达和MVD与肿瘤大小、转移与否密切相关.结论:Raf-1是调控人结肠癌组织血管生成的关键分子,在癌组织中Raf-1的表达与MVD值成正相关,两者与临床上肿瘤的大小、转移与否密切相关.
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格尔德霉素对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响及其机制探讨
目的:研究格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人卵巢癌SKOV3细胞的体外抑制作用,探讨GA抑制SKOV3细胞增殖及诱导其凋亡的可能机制.方法:MTT法检测GA单独或联合顺铂(cisplatin)对SKOV3细胞的增殖抑制作用；FCM法检测GA作用后SKOV3细胞周期及凋亡率的变化；分别应用免疫细胞化学法(immunocytochemistory,ICC)和FCM法检测GA处理SKOV3细胞48 h后细胞内Akt、Raf-1蛋白的表达变化.结果:GA对SKOV3细胞的体外增殖可产生明显的抑制作用(P＜0.05),该作用随着GA浓度的增高和作用时间的延长而增强.而且,GA可增强顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用,在一定浓度范围内随着GA浓度的增高,两药联合应用对SKOV3细胞的增殖抑制作用越强.经0～2 000 nmol/L GA作用SKOV3细胞48 h后,G2/M期细胞逐渐增多,细胞凋亡率也显著升高(P＜0.05).ICC和FCM法检测结果均表明,经0～2 000 nmol/L GA处理48 h后,SKOV3细胞中Akt、Raf-1蛋白的表达水平随着药物浓度增高而逐渐降低(P＜0.05).结论:GA能够对卵巢癌SKOV3细胞产生明显的体外增殖抑制作用,并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调卵巢癌细胞中Akt 和Raf-1蛋白表达相关.
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EGFR信号通路相关分子在上皮性卵巢癌表达的研究
目的:探讨EGFR、Akt、Raf-1、ERK mRNA在上皮性卵巢癌组织中表达的临床意义、相关性及对预后的影响.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测14例正常卵巢组织、16例卵巢良性肿瘤组织及61例上皮性卵巢癌组织中EGFR、Akt、Raf-1、ERK mRNA的表达,并分析它们与临床病理参数之间的关系及其相关性.结果:卵巢癌组织中EGFR、Akt、Raf-1、ERK阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤组织(P＜0.05);EGFR、Akt表达水平与卵巢癌手术病理分期、细胞学分级及淋巴结转移有关(P＜0.05),Raf-1表达水平与手术病理分期及淋巴结转移有关(P＜0.05);ERK表达水平与细胞学分级有关(P＜0.05);两两比较,EGFR与Raf-1,Akt与Raf-1,Akt与ERK,Raf-1与ERK mRNA的表达呈正相关(P＜0.05).结论:上皮性卵巢癌组织EGFR、Raf-1、Akt、ERK的过表达与卵巢癌的发生发展及侵袭有关,可能为多靶点联合治疗提供新方向.
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多发性骨髓瘤患者miRNA-497和Raf-1的表达水平及其临床应用价值
目的 探讨miRNA-497和Raf-1在多发性骨髓瘤(MM)骨髓中的表达水平及其意义.方法 选取2015年1月-2017年8月住院多发性骨髓瘤初诊患者52例和正常对照组30例作为研究对象,采用定量逆转录-聚合酶链反应法检测骨髓单个核miRNA-497的表达水平,免疫组织化学法检测Raf-1表达水平.结果 miRNA-497在MM中明显低于正常对照组;Raf-1蛋白在MM中明显高于正常对照组;不同期别MM的miR-497及Raf-1蛋白的表达水平之间进行比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-497和Raf-1的表达与多发性骨髓瘤患者的发病机制、疾病进展相关,可以作为MM的疾病进展及预后判断指标.
关键词： 多发性骨髓瘤 非编码微小RNA-497 RAF-1 -
信号蛋白质14-3-3研究进展
14-3-3信号蛋白质家族是一组高度保守,分布十分广泛的多功能真核生物蛋白质,具有7个亚型,与各种信号肽分子包括激酶、磷酸酶、膜转移受体等结合,参与细胞内信号传导包括有丝分裂信号转导、细胞周期调节、细胞凋亡等,并对朊蛋白病有重要诊断价值.
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蟾蜍灵抑制食管癌细胞增殖、迁移和趋化运动的机制研究
目的 通过培养人食管癌TE13细胞株,观察蟾蜍灵对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、趋化运动及Raf-1、磷酸化Raf-1(p-Raf-1)表达的影响,阐明蟾蜍灵抑制食管癌转移的作用机制,为临床治疗提供实验依据.方法 培养TE13细胞,通过MTT方法检测细胞药物毒性及对细胞增殖的影响,通过细胞划痕试验检测蟾蜍灵对迁移的抑制作用.通过Boyden小室实验检测蟾蜍灵处理后的食管癌细胞株TE13的趋化运动.采用免疫组织化学和Western blot检测蟾蜍灵处理后Raf-1、p-Rat-1蛋白的表达.结果 MTT结果显示,TE13细胞的增值抑制率随着蟾蜍灵浓度的增加(10、25、50、100和200 nmol/L)而升高(P＜0.05).划痕实验结果显示,不同溶度的蟾蜍灵处理TE13细胞后,TE13细胞的迁移能力随着蟾蜍灵浓度的增加而降低.Boyden小室实验结果显示,10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理后的食管癌细胞穿过滤膜细胞数量与对照组比较明显减少(P＜0.05).Western blot结果显示,各组Raf-1蛋白的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).25、50和100 nmol/L蟾蜍组p-Raf-1的表达量与对照组比较明显减少(P＜0.05).免疫组织化学检测结果显示,各组Raf-1蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05).25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组的p-Raf-1阳性细胞数及棕黄色颗粒数与对照组比较明显减少(P＜0.05).结论 当蟾蜍灵的药物浓度＜200 nmol/L时,食管癌TE13细胞增殖的抑制作用不能通过其细胞毒性实现.蟾蜍灵对食管鳞状细胞癌TE13细胞株的迁移、趋化运动能力有明显的抑制作用.蟾蜍灵不抑制Raf-1蛋白表达,但可以降低p-Raf-1在食管鳞状细胞癌TE13细胞株的表达,提示可能通过抑制Raf-1的激活抑制ERK通路,从而抑制食管鳞状细胞癌TE13细胞株的转移.
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腺病毒siRNA沉默Raf-1基因抑制异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚
目的 研究Raf-1 siRNA重组腺病毒载体对大鼠心肌肥厚的作用并探讨其机制.方法 构建Raf-1腺病毒siRNA载体,大鼠随机分为正常对照组、心肌肥厚组、无关siRNA组、Raf-1 siRNA干预组,皮下注射异丙肾上腺素(ISO)制备大鼠心肌肥厚模型,无关siRNA组及Raf-1 siRNA干预组注射ISO后,分别经心包腔注射重组腺病毒pAd-siCon及pAd-siRaf-1,4周后染色测定全心重指数(HWI)、心肌细胞横截面积(CSA)、心肌间质胶原容积分数(CVF)及血管周围胶原面积(PVCA),western blot检测心肌Raf-1、NF-κB及ERK1/2蛋白表达,RT-PCR检测TNF-α、MCP-1、TGF-β 1 mRNA表达.结果 与心肌肥厚组相比,Raf-1 siRNA干预组可降低大鼠HWI、CSA、CVF及PVCA,下调Raf-1、NF-κB、ERK1/2蛋白及TNF-d、MCP-1、TGF-β1 mRNA表达;无关siRNA组与心肌肥厚组相比无明显差异.结论 Raf-1 siRNA重组腺病毒载体能减轻大鼠心肌肥厚,其作用可能与抑制Raf-1/NF-κ B、Raf-1/ERK1/2信号转导及下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、转化生长因子-β (TGF-β)表达相关.
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格尔霉素降低Raf-1和AKt水平诱导神经母细胞瘤凋亡的研究
目的:探讨格尔霉素(GA)是否会改变对神经细胞的存活起关键作用的信号传导蛋白Raf-1和AKT的表达,诱导神经母细胞瘤细胞凋亡.方法:在不同时间内用GA处理人神经母细胞瘤细胞(SH-sy5y,SK-N-SH,LAN-1),MTT分析细胞存活率,DNA碎片ELISA流动细胞计数Western Blot分析凋亡情况.结果:GA能降低Raf-1和AKT的活性,激活Caspase-9和Caspase-3,线粒体释放细胞色素C继之切割PARP,诱导细胞凋亡.结论:GA可能是一种有效治疗神经母细胞瘤的药物.
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Raf-1磷脂酸结合结构域(Raf-1-PABD)融合蛋白的表达及其对细胞内磷脂酸的示踪作用
目的 构建示踪细胞内磷脂酸的工具.方法 人Raf-1基因磷脂酸结合结构域(Raf-1-PABD)能特异性结合磷脂酸,通过PCR和酶切Raf-1-PABD序列,并连接至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的载体,测序鉴定正确后,细胞转染pcDNA3.0-mitoPLD-HA质粒表达线粒体磷脂酶D(mitoPLD)产生大量磷脂酸,同时以Raf-1-PABD-EGFP融合蛋白结合产生的磷脂酸以示踪细胞内磷脂酸的量以及细胞内磷脂酸的改变.结果 重组工具载体pEGFP-C1-Raf-1-PABD(磷脂酸结合蛋白)构建并成功表达,可示踪线粒体融合过程中磷脂酸的改变.结论 成功构建了示踪细胞内磷脂酸水平的pEGFP-C1-Raf-1-PABD的载体,将其转染NIH3T3细胞进行表达,可用于细胞内线粒体中磷脂酸的示踪.
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结肠癌裸鼠移植瘤中Raf-1的表达与肿瘤血管生成的相关性
目的:研究Raf-1在结肠癌裸鼠移植瘤中的表达与肿瘤血管生成的关系.方法:通过Western blot方法检测不同结肠癌细胞系(HT.29、SW480、IS174T)中Raf-1的表达,然后将表达差异较大的2株细胞(HT-29、LS174T)分别接种到BALB/C nu/nu小鼠体内,分别观察肿瘤的生长速度、瘤重变化等情况,后通过免疫组化的方法分别检测瘤组织中Raf-1的表达及肿瘤微血管密度(MVD)的情况,分析二者的相关性.结果:在裸鼠移植瘤模型中,LS174T组移植瘤生长速度及瘤重大于HT-29组;免疫组化结果显示Raf-1在LS174T组中的强阳性率为50%,在HT-29组中为10%,两组之间的差异有统计学意义(P<0.01);在LS174T组中MVD平均值为28.32±5.2,HT-29组MVD平均值为19.23±4.7,两组之间MVD值差异有统计学意义(P<0.01).结论:Raf-1是调控肿瘤组织血管生成的关键分子,在结肠癌裸鼠移植瘤中Raf-1的表达与MVD值成正相关.
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Raf-1在恶性黑色素瘤中作用机制的研究现状
许多信号通路都参与了细胞的增殖分化,以及凋亡的过程,其中备受关注的是Ras-Raf-MEK-ERK通路。 Raf激酶是这一信号通路的节点蛋白,在肿瘤发展的整个过程中起到了非常重要的作用。而Raf-1,Raf的家族成员之一,在调控细胞凋亡过程中也发挥着关键作用,它可通过多种途径调控细胞凋亡。越来越多的证据,包括表型的Raf-1-/-小鼠提示Raf-1可能有独立于MEK激活剂的作用的其他职能来保护有关抗凋亡。在哺乳动物细胞中MST2由应激信号激活,并在高表达时导致细胞凋亡。其果蝇同系物Hippo在分化过程中调节细胞凋亡和细胞周期阻滞。 Raf-1通过防止其二聚作用、获取一个MST2上活化磷酸化磷酸酶来抑制MST2。 ERK通路由siRNA调控的MST2的下调可恢复Raf-1-/-小鼠成纤维细胞凋亡超敏性。相比之下,在Raf-1+/+细胞和人类癌细胞系中Raf-1与MST2下调增强了对Fas诱导细胞凋亡的易感性。 MST2：Raf-1复合体由应激信号及分裂素解离。应激信号激活MTS2并触发细胞凋亡。分裂素只能使MST2通过从Raf-1释放被激活。因此,通过链接有丝分裂和细胞凋亡信号,MST2：Raf-1复合体可作为防止细胞无节制增殖的保障。
