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外伤性眼球萎缩眼视神经组织中bcl-2相关死亡基因bad的表达及其意义
目的探讨外伤性眼球萎缩眼视神经组织中bcl-2相关死亡基因bad表达情况及其意义. 方法用免疫组织化学的方法观察8只正常对照尸体眼、31只外伤性眼球萎缩眼视神经组织中bad的表达情况. 结果眼球萎缩眼视神经退行性变表现为视神经髓鞘进行性脱失,神经胶质细胞增生补充.bad表达于正常视神经髓鞘组织及眼球萎缩眼视神经残存髓鞘组织,束间隔及神经胶质细胞中无bad表达.眼球萎缩眼残存的视神经组织较正常视神经组织bad表达量有增高趋势(P＜0.05);但与眼球萎缩病程长短及导致眼球萎缩的病因之间无直接线性关系(P＞0.05). 结论 bad可能具有促进外伤性眼球萎缩眼视神经退行性变的作用.
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嵌合型bcl-2反义寡核苷酸对体外培养葡萄膜黑色素瘤细胞存活的影响
目的探讨抗凋亡基因bcl-2表达对体外培养的葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)细胞存活的影响.方法通过阳离子脂质体将bcl-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODN)转导原代培养UM细胞,应用噻唑蓝(3,-4,5 Dimethyliazol -2,5 diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法测定bcl-2 AS-ODN对肿瘤细胞增生的抑制作用;提取肿瘤细胞DNA,检测肿瘤细胞的凋亡情况;利用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白印迹(Westernblot)技术,从RNA及蛋白水平测定bcl-2 AS-ODN对肿瘤细胞bcl-2表达的影响.结果 bcl-2 AS-ODN对UM细胞的增生有明显抑制作用,并且其抑制作用随浓度的增高而增强.bcl-2 AS-ODN在mRNA及蛋白水平对bcl-2基因表达产生明显抑制作用,而正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)对肿瘤细胞的增生则无明显的抑制作用.结论 bcl-2 AS-ODN在转录和翻译水平下调bcl-2基因表达,抑制UM细胞增生并诱导其凋亡.
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视网膜母细胞瘤中Fas/Fas配体表达及与凋亡的关系
目的观察视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB) Fas/Fas配体 (Fas ligand ,FasL)表达及与凋亡的相关性。方法应用免疫组织化学染色法观察32例RB标本中 Fas/FasL的表达及分布,并对32例用光镜、其中4例用电镜及12例用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化脱氧尿苷三磷酸末端标记 (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotin-dUTP nick-end labeling, TUNEL)染色观察细胞凋亡，分析与Fas/FasL表达的关系。结果光镜下凋亡细胞主要位于RB退化区，电镜下可见染色质边集和凋亡小体等凋亡特征； TUNEL显示阳性标识主要位于RB退化区及死亡区。Fas及 FasL在所有RB中均呈阳性表达。Fas和 FasL表达与凋亡指数 (apoptosis index, AI)呈正相关 (P<0．01，P＜0．001)。结论凋亡在RB中普遍存在，可能是触发RB细胞死亡的主要方式；Fas系统在RB的发生发展中起重要作用。Fas系统上调可能会诱导RB细胞凋亡。
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实验性视网膜脱离时神经生长因子对视网膜细胞凋亡的干预作用
目的 研究神经生长因子(NGF)在实验性视网膜脱离(RD)时对视网膜细胞凋亡的干预作用.方法 27只大鼠左、右眼分别被分为实验对照组和NGF组.视网膜下注射透明质酸钠建立RD动物模型后,取右眼在玻璃体腔内注射1 μg/μl NGF,共5μl,作为NGF组;左眼注射磷酸盐缓冲液(PBS)5μl,作为实验对照组.注射方法为每4天注射1次,直至观察期结束.两组在建立模型后1.5、3、6、12 h、1、2、4、8、16、32 d分别取眼球.另设立正常对照组2只大鼠,不作任何处理,在实验观察结束时取眼球.采用原位末端标记法(TUNEL)和透射电子显微镜观察视网膜细胞凋亡情况,并进行细胞计数和统计学检验.结果 RD早期就有细胞凋亡的发生.视网膜各层细胞均可见凋亡细胞,内、外核层分布多.凋亡细胞数随脱离时间延长而增加(P＜0.01).NGF组的凋亡细胞数比实验对照组少(P＜0.01).结论 实验性RD中,玻璃体腔内给予外源性NGF能抑制视网膜细胞凋亡的发生.
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不同激光强度经瞳孔温热疗法对色素兔视网膜细胞调亡的影响
目的观察不同激光能量的经瞳孔温热疗法(TTT)对色素兔视网膜的病理损伤及对细胞凋亡的影响.方法将14只有色家兔随机按不同激光能量分为空白组、50、70、90、110、130、150 mW组,每组2只兔4只眼行TTT治疗照射后,分别于24、48 h后取视网膜组织进行光学显微镜检查及用原位末端转移酶标记(TUNEL)技术和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果直接检眼镜下激光反应斑颜色随能量增加由灰变白逐渐变浅,即由灰白--白--浓白,直径逐渐增大.苏木素-伊红(HE)染色:50～70mW组光学显微镜下视网膜各层结构无明显改变;90～130 mW组视网膜结构完整,视锥、视杆细胞肿胀,内颗粒层可见少量的固缩核和细胞浆空泡化.以上能量组激光照射后24、48 h,光学显微镜下视网膜结构与空白对照组无明显差别.150 mW组激光照射后24 h视网膜组织各层肿胀、变性,感光细胞内外节部分缺失;而激光照射后48 h视网膜组织可见明显坏死,全层均可见细胞缺失.TUNEL检测结果显示,各能量组外颗粒层均可见阳性细胞,随激光能量的增加而增加,并逐渐累及内颗粒层和神经节细胞层.流式细胞仪检测结果显示,激光照射后24 h,各能量组均可见细胞凋亡峰.结论兔视网膜在能量为50～70 mW的TTT照射后,视网膜组织未见明显改变,但感光细胞凋亡显著增加.随着TTT激光能量增加,视网膜组织出现肿胀、变性甚至坏死.细胞凋亡逐渐累及内颗粒层和神经节细胞层.
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体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究
目的研究体外光动力疗法(PDT)诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡情况.方法将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度(1.0 μg/ml)相当的光敏剂verteporfin共同孵育,根据孵育时间的不同,每种细胞分成6组:0、5、15、30、60、120 min组.孵育至上述时间后,分别用光敏剂大吸收波长光照(689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光),能量密度为2.4J/cm2,光照时间为83 s.用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例,实验重复进行3次.结果PDT后3 h,血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为:0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02;RPE细胞各组的凋亡比例分别为:0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03;两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加;两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P＞0.05).结论PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡,在相同的体外环境下,PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性.
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蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡
目的观察蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的影响. 方法用蓝光照射体外培养的人RPE细胞,分为3组,A组:不同光照强度;B组:同一光照强度,不同光照时间;C组:同一光照强度和光照时间,不同细胞培养终止时间.利用末端脱氧核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化吡啶(Annexin V-FITC/PI)双染流式细胞检测、透射电子显微镜等手段观察细胞凋亡. 结果 TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,细胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞.透射电子显微镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失;粗面内质网扩张;溶酶体增加,内含代谢产物.A组低于一定阈值[(500±100)lx]的蓝光光照对RPE细胞损伤较轻,细胞凋亡及坏死随光照强度的增强而增加;B组随着光照时间延长,RPE细胞凋亡数量没有增加,而细胞坏死逐渐增加;C组光照后6、12 h,损伤以细胞凋亡为主,但随着光照时间延长,凋亡继发坏死细胞和坏死细胞明显增加. 结论蓝光照射可引起体外培养的人RPE细胞损伤,损伤形式有凋亡、凋亡继发坏死及坏死;损伤程度呈光照强度和光照时间依赖性.
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雌激素对鼠视网膜缺血再灌注所致视网膜损伤的保护作用
目的探讨雌激素对大鼠视网膜缺血再灌注所致视网膜损伤的保护作用.方法60只去势雌性SD大鼠随机分为2组,行前房灌注,建立视网膜缺血再灌注(RIR)模型.实验组在升高眼压前2 h按100 μg/kg的剂量皮下注射17β-雌二醇.对照组大鼠皮下注射等量生理盐水.分别在灌注前,再灌注后12、24、48、72 h对视网膜进行常规HE染色切片,观察细胞丢失情况及测量视网膜内层厚度.采用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL法)检测视网膜组织中凋亡细胞的表达.结果实验组再灌注后24、48 h的凋亡细胞数目明显低于对照组(P＜0.05),光学显微镜下计数视网膜神经节细胞数较对照组多(P＜0.05).结论雌激素对缺血再灌注所导致的视网膜损伤具有保护作用.
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染料木黄酮对培养的人视网膜色素上皮细胞增生和凋亡的影响
目的观察不同浓度染料木黄酮对培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)的增生和凋亡的影响. 方法通过四唑溴盐(MTT)比色法和核仁嗜银蛋白(AgNORs)染色分析,观察不同浓度(5、10、25、50、75、100 mg·L-1)染料木黄酮作用12、24、48、72 h后对RPE细胞增生的影响.通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色与光学显微镜和透射电子显微镜的形态学观察,研究其对RPE细胞凋亡的诱导作用,并与正常培养的人RPE细胞对照比较. 结果 25、50、75、100 mg·L-1浓度的染料木黄酮可抑制RPE的增生,抑制率为12.0%～64.6%,与正常RPE细胞相比,差异有显著性的意义(P＜0.05);随药物剂量的增加和作用时间的延长细胞核内AgNORs数量减少.TUNEL染色结果显示,50 mg·L-1染料木黄酮作用24、48和72 h后,RPE细胞的凋亡百分数的中位数分别为7.6%、9.8%和13.7%.当浓度为75、100 mg·L-1时,以上3个时间点凋亡细胞百分数的中位数分别为10.3%、16.4%和23.4%;15.4%,21.2%和35.8%.透射电子显微镜观察结果显示,50 mg·L-1染料木黄酮作用48 h后,RPE细胞核内呈现凋亡特征. 结论不同浓度的染料木黄酮可以抑制RPE细胞的增生,有剂量效应关系和时间效应关系;当达到一定浓度时,染料木黄酮可以诱导RPE凋亡的发生.
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N-甲基-N-亚硝脲诱导大鼠视网膜光感受器细胞凋亡
目的探讨N-甲基-N-亚硝脲(MNU)对大鼠视网膜光感受器细胞毒性作用的机制. 方法将生后50 d的雌性SD大鼠30只分别按60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射MNU.在注射MNU 12、24、48、72 h和7 d后,颈椎脱臼法处死大鼠,取出眼球,做病理切片.另6只生后50 d的雌性SD大鼠为正常对照.用TUNEL试剂盒和透射电镜检测光感受器细胞凋亡;免疫组织化学方法检测MNU作用不同时间视网膜细胞内增生细胞核抗原(PCNA)、弹性蛋白和胶质纤维酸蛋白(GFAP)的表达. 结果MNU作用后极部视网膜光感受器细胞12、24、48、72 h和7 d后的凋亡指数分别是(33.6±2.3)%、(46.5±5.7)%、(20.1±5.3)%、(8.2±3.6)%和(2.0±0.8)%.在MNU作用后24 h,大部分光感受器细胞出现核固缩;24 h后,内颗粒层及内颗粒层和脉络膜之间有PCNA表达,72 h达高峰,7 d后明显减少;24 h后,内颗粒层和外颗粒层开始出现GFAP和弹性蛋白的阳性表达,72 h达高峰,7 d后明显减少.结论MNU可选择性地诱导视网膜光感受器细胞发生凋亡及引起Müller细胞增生.
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视网膜对铁的敏感性与抗坏血酸分布的相关性研究
目的观察大鼠和家兔视网膜组织中抗坏血酸的分布形式与铁异物对2种不同动物的视网膜损伤形态,验证大鼠视网膜光感受器细胞对铁异物的敏感性是否与视网膜中抗坏血酸的分布有关. 方法将5 mg铁异物分别置入32只健康雄性Sprague-Dawley (SD ) 大鼠、15 mg铁异物分别置入9只健康雄性新西兰白色家兔玻璃体腔后,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察2种不同种动物视网膜的受损情况.凋亡原位染色(TdT-mediated dUTP-biotin nick-end labeling, TUNEL)方法观察家兔视网膜神经元的细胞凋亡.Chinoy 法染色观察抗坏血酸在2种不同的正常动物视网膜组织中的分布形式. 结果 SD大鼠铁异物置入术后,HE染色的切片仅见光感受器细胞层的破坏.新西兰白色家兔铁异物置入术后3 d,HE 染色见全层视网膜神经元细胞受损,在神经节细胞层、内颗粒层以及外颗粒层均观察到TUNEL阳性细胞核.正常SD大鼠抗坏血酸阳性染色仅见于外颗粒层;新西兰家兔视网膜全层抗坏血酸染色阳性. 结论视网膜对铁异物毒性的敏感性与视网膜组织中的抗坏血酸分布形式有关.
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转基因鼠晶状体特异性表达的制瘤素对眼发育的影响
目的研究晶状体特异性表达的制瘤素(oncostatin M,OSM)对眼发育的影响.方法将去除部分序列的小鼠OSM cDNA[661碱基对(base pair,bp)]连接到αA-晶状体蛋白(αA-crystallin)启动子上,然后用显微注射的方法将其导入单细胞胚胎内,建立转基因鼠.常规组织学及免疫组织化学方法对转基因鼠进行特性鉴定,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶末端标记(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labelling,TUNEL)试验检测细胞凋亡,原位杂交检测caspase-3mRNA的表达,兔抗活化的caspase-3抗体检测活化的caspase-3蛋白质.结果胚胎期14.5、17.5 d,转基因蛋白OSM特异性表达于晶状体纤维细胞内,从胚胎期17.5 d开始,转基因鼠视网膜开始发生变性,出生时,50%以上的视网膜细胞丢失.TUNEL试验显示转基因鼠视网膜细胞凋亡.转基因鼠视网膜细胞中caspase-3被激活.结论晶状体特异性的OSM表达激活caspase-3,导致了眼的异常发育、细胞凋亡及广泛的视网膜变性.
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Fas/FasL在视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及碱性成纤维细胞生长因子的治疗作用
目的探讨Fas/FasL在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF )的治疗作用. 方法前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型,28只大鼠随机分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为缺血再灌注组,右眼为治疗组(玻璃体腔内注射bFGF),手术组又按照再灌注后不同时间段分为1、6、12、24、48、72 h组.应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick-end,TUNEL)法检测视网膜神经细胞凋亡指数(apoptosis index,AI),免疫组织化学法检测视网膜组织中Fas、FasL的表达. 结果视网膜神经细胞的凋亡出现于再灌注后6 h,并逐渐递增,24 h达到高峰,48 h开始下降,72 h组不明显.Fas、FasL表达改变与凋亡的神经细胞改变基本一致.bFGF治疗组各观察指标表达变化规律与缺血组基本一致,但AI值在12、24、48 h组明显低于缺血组(P＜0.05);Fas表达在6、12、24 h组较缺血组显著下降(P＜0.05);FasL表达在12、24、48 h组较缺血组明显下降(P＜0.05). 结论 Fas/FasL死亡诱导系统参与视网膜缺血再灌注损伤,导致神经节细胞的凋亡;bFGF可抑制Fas、FasL的表达,减少神经节细胞凋亡,对视网膜缺血再灌注损伤有治疗作用.
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生长因子对培养的胚胎视网膜神经细胞增殖与凋亡的影响
目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)及胎牛血清对体外培养的人胚胎视网膜神经细胞生长、增殖、分化和凋亡等的影响及可能的机制. 方法采用胎牛血清培养人胚胎视网膜神经细胞,加入或不加入EGF、FGF.通过神经元特异稀醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、视网膜神经节细胞特异的Thy1.1抗体、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫组织化学染色、倒置显微镜及扫描电镜观察鉴定细胞成分;细胞生长曲线及溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)掺入测定细胞增殖率;原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(Tdt-mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)检测细胞凋亡;c-fos、c-jun及bcl-2、bax免疫组织化学染色判断转录调控因子及细胞凋亡调控因子表达水平,计数阳性细胞并进一步作统计分析. 结果经过EGF、FGF培养的人胚胎视网膜细胞总数增加,细胞倍增时间缩短,BrdU掺入率增加,凋亡细胞数减少,其中NSE、Thy1.1阳性细胞数明显增加.同时,c-fos、c-jun及bcl-2阳性细胞数也增加. 结论生长因子EGF、FGF可通过上调转录因子c-fos、c-jun及细胞凋亡抑制因子bcl-2表达促进体外培养的人胚胎视网膜细胞存活与增殖.
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碱性成纤维细胞生长因子对可见光诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响
目的观察外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对可见光诱导培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的影响. 方法以(2 000±500) lx白色荧光灯照射培养的人RPE细胞,利用荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(annexin V-fluorescein isothiocyanate/ propidium iodium,Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞测定、细胞免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫测定等方法,检测加入不同浓度的bFGF后,培养的RPE细胞的凋亡及细胞内bFGF、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)基因及半胱天冬酶-3(caspase-3)的变化. 结果 (1)分别加入外源性bFGF 10 、20 ng/ml时, RPE细胞凋亡比单纯光照组明显减少(P＜0.05);(2)加入bFGF 10 ng/ml组的bcl-2蛋白表达比单纯光照组明显增加(P＜0.01),而与无光照组之间差异无显著性意义(P＞0.05);(3)光照后bcl-2 mRNA表达比无光照组下降,但随着加入bFGF浓度的增高, bcl-2 mRNA表达又逐渐增加,当加入bFGF 20 ng/ml时,bcl-2 mRNA的表达与无光照组之间差异无显著性意义(P＞0.05);(4)无论是单纯光照组还是光照时加入各种浓度的bFGF组,其内源性bFGF及FGFR1的表达均较无光照组显著增加(P＜0.05),并呈bFGF浓度依赖性;(5)与单纯光照组比较,光照组加入外源性bFGF 10 ng/ml后,细胞内caspase-3活性明显降低(P＜0.05). 结论外源性bFGF可能通过RPE细胞内bFGF、FGFR1、 bcl-2的表达上调,caspase-3活性降低,而抑制可见光诱导的培养的人RPE细胞凋亡.
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缺血再灌注损伤诱导大鼠视网膜细胞凋亡
目的观察缺血再灌注大鼠视网膜损伤及细胞凋亡情况. 方法采用升高大鼠眼压到109.725 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)持续1 h的方法制作视网膜缺血再灌注模型,采用常规眼球切片观察不同缺血和再灌注时间的视网膜损伤的组织病理改变;采用DNA琼脂糖凝胶电泳法检测视网膜神经元凋亡情况;采用DNA原位末端标记(terminal dUTP nick end labelling, TUNEL)法定位凋亡的视网膜细胞. 结果缺血30 min 再灌注24、48 h的大鼠视网膜无明显的病理改变; 缺血60 min再灌注24、48 h的大鼠视网膜神经节细胞层和内核层细胞明显变薄;缺血60 min再灌注12、24 h的大鼠视网膜有梯状条带.而正常对照组、缺血30 min再灌注24、48 h组及缺血60 min再灌注48 h组大鼠视网膜均无类似表现.TUNEL法显示视网膜内的细胞凋亡主要发生在节细胞和内核层光感受细胞. 结论大鼠视网膜缺血再灌注主要是导致视网膜神经节细胞层和内核层细胞损伤,细胞凋亡可能是损伤的重要机制.
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缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因 bcl-2表达的影响
目的观察缺氧对培养的牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响. 方法用四甲基偶氮唑蓝 [ 3-(4,5-dimethylthiazole-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid, MTT]比色法和免疫组织化学的方法,将培养的RPE细胞接种于24孔板,每孔细胞密度为5×104,分成4组:A组置入缺氧环境中培养(3%O2,5%CO2,92%N2,37℃);B组置入正常环境中培养(5%CO2,95%空气,37℃);C组:将缺氧环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养;D组:将正常环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养.24 h后分别取出行MTT比色法及抗bcl-2蛋白抗体染色. 结果 A组与B组、C组与D组比较,前者细胞MTT实验吸光度(A)值[旧称光密度(OD)]均高于后者(P＜0.05); 抗bcl-2蛋白抗体染色,A、B组阳性率分别为72.60%、38.64%; C、D组阳性率分别为83.20%、21.80%.阳性染色在细胞浆,近核膜处染色尤深,部分呈细颗粒状. 结论缺氧促进牛 RPE细胞增生及凋亡基因 bcl-2表达.
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可见光照对培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响
目的研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的影响.方法以白色荧光灯为光源,用5001x、(2 000+-500)1x及(3 400±200)1x不同光照强度,按不同的光照时间(无光照、6、12、24 h)照射培养的人RPE细胞.利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling,TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium,AnnexinV-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36 h组).结果可观察到RPE细胞出现两种死亡形式,凋亡与坏死.(1)低于一定阈值(500 1x)的光照对细胞损伤较轻,细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加.(2)在较短的光照时间(6 h和12 h)内,细胞死亡的增加以凋亡为主;随着光照时间的延长,细胞坏死逐渐明显.(3)随着光照后培养时间的延长,细胞凋亡明显增加(P＜0.05).光照后6、12、24 h的损伤改变以凋亡为主,但随时间的延长,凋亡继发性坏死的增加显著.光照后36 h,细胞的坏死数显著增高(P＜0.01).结论可见光超过一定照度(5001x)可导致培养的人RPE细胞凋亡及坏死的显著增加,其损伤程度为光照强度及时间依赖性.较低光照强度及较短光照时间主要诱导细胞凋亡,反之则导致细胞坏死.
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L-精氨酸和左旋-硝基精氨酸甲酯对纯化视网膜神经节细胞凋亡的影响
目的探讨L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)和左旋-硝基精氨酸甲酯(L-nitro-arginine-methyl -ester, L-NAME)对纯化培养的视网膜神经节细胞(retinal gangal cells, RGCs)凋亡的影响. 方法同化培养液培养抗体纯化的Sprague-Dawley(SD)系大鼠RGCs;在纯化培养的RGCs中分组加入体积百分浓度为1×10-6、1×10-5、 1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1 mol/L的L-Arg及L-NAME,培养24 h后检测各组培养上清液中硝酸盐含量、细胞的活性;培养 48 h后检测各组细胞的凋亡及细胞中bcl-2、bax及 p53 mRNA的表达. 结果培养上清液中硝酸盐含量随着L-Arg体积百分浓度的增高而增高,随着L-NAME体积百分浓度的升高而降低.低体积百分浓度时,随着L-Arg和L-NAME体积百分浓度的增加bcl-2 mRNA表达逐渐增高,bax及p53 mRNA的表达无明显变化.而高体积百分浓度时则相反. 结论 L-Arg低体积百分浓度时能促进RGCs的生长,高体积百分浓度时则促进细胞凋亡;L-NAME对L-Arg的毒害作用则起抑制作用.
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BaX过表达诱导培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡观察
目的研究外源性促凋亡基因bax过表达对培养人的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium ,RPE)细胞凋亡的影响.方法通过脂质体Lipofectin介导法用含入全长bax基因片段的真核表达载体PMDNA3-hbax质粒转化体外培养的RPE细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,提取实验组细胞DNA进行DNA梯度电泳. 结果 Zn2+可诱导PMDNA3-hbax转化组RPE细胞出现明显的凋亡峰,凋亡峰位于单倍体和二倍体之间,凋亡率为36%,DNA电泳可见DNA梯状条带,PMDNA3空载体组及未转染组RPE细胞未见亚二倍峰和DNA梯状条带出现.结论外源性促凋亡基因bax过表达可诱导RPE细胞凋亡.
