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microRNA 转基因小鼠在心脏发育研究中的应用
microRNA(miRNA) 参与调控胚胎心脏的发育,在心脏形态发生、心肌细胞生长及分化过程中发挥着极其重要的作用.通过转基因技术可以实现特异 miRNA 在心肌组织的过表达与敲除,据此建立的心肌特异性 miRNA 转基因小鼠模型可以在整体水平揭示 miRNA 心脏方面的功能.近年,以 miRNA 为研究对象的心肌特异性转基因小鼠模型数量不断增加.
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与心脏发育相关的miRNA研究
microRNA(miRNA)是生物体内源长度约为20～23个核苷酸的非编码小RNA,在生物体发育、细胞增殖与分化等过程中扮演了重要角色.心脏是人体的重要器官之一,miRNA与心脏发育密切相关,很多分子生物学研究技术已经应用到对心脏发育的研究中,研究表明一些特异miRNA有可能为心脏疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.
关键词： 心脏发育 生物芯片 基因敲除 microRNA沉默与过表达 -
Nkx2-5、GATA-4转录因子在心脏发育中的作用
心脏是胚胎发育过程中先形成的器官.导致心脏形成和发育的确切机制目前还不清楚.转录因子以组织特异性和定量的方式调节其它器官形成和发育,从而在胚胎发育过程中起主要的调节作用.转录因子在心脏发育过程中可以调节心肌特异性基因的表达.
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Notch信号通路与心脏发育、先天性心脏病及心肌再生
Notch信号通路在细胞决定、发育、分化、增殖、凋亡、粘附及上皮-间质细胞转化过程中发挥重要作用,并参与了心脏发育的关键过程,也与心肌再生修复密切相关,Notch位点突变可引起一系列心脏畸形.本综述将集中讨论Notch信号通路及其在心脏发育、先天性心脏病和心肌再生中的作用.
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微小RNAs与心脏发育及疾病
微小RNAs(microRNAs)是一类内源性17～25个核苷酸大小的非编码RNA分子,能调节转录后靶基因的表达,在机体的生长发育、神经分化、细胞增殖、代谢和凋亡等过程中发挥重要作用.研究表明:microRNAs参与了心脏发育,多种miRNAs (miRNA-1, 133, 206 等)基因的表达变化影响心脏的正常发育.microRNAs的水平变化与心律失常、心肌梗死、心肌重构和心力衰竭等心脏疾病的形成亦密切相关.
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MEF2转录因子家族与心脏发育及心血管系统相关疾病的关系
肌细胞增强因子-2(MEF2A)是心肌细胞特异性基因表达和转录的中心调控因素.通过与基因启动子中特异序列结合,从而发挥对肌细胞特异性基因表达、转录的调控作用.近期研究表明,冠心病易感基因MEF2A的突变会影响其转录产物MEF2A蛋白的空间构象,减弱其在肌细胞信号介导的转录激活效能,进而导致血管内皮发育不良、单核细胞浸润,启动动脉粥样硬化斑块的形成.
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靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定
目的 利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPERhole)及筛选稳定产毒的细胞克隆.方法 化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-hole).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果.结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达.结论 靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功.
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人类心脏发育候选基因ZNF569的生物信息学分析
目的 分析人类心脏发育候选基因ZNF569的生物信息学,对其功能研究提供指导意见.方法 利用生物信息学网站及生物软件对人类心脏发育候选基因ZNF569进行生物信息学分析.结果 ZNF569是一个新的人类KRAB/C2H2型锌指蛋白基因.此基因在基因组DNA上长约56.28 kb,定位于19q13.12.开放阅读框全长2061个碱基,含6个外显子,5个内含子,编码一个长686个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白包含一个KRAB结构域和18个锌指结构域,进化分析表明各种真核生物中都存在ZNF569的同源蛋白,而ZNF569蛋白与鼠ZNF74蛋白的相似度达到94%,它们之间的蛋白质序列保守度更高.ZNF569本身18个锌指结构蛋白质序列也高度保守.结论 ZNF569及其同源蛋白构成了一个在进化中高度保守的新的KRAB-ZF基因,而它的功能尚未见报道.
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筛选控制果蝇心脏发育的基因
果蝇的早期心脏发育模式与脊椎动物的早期心脏发育模式具有惊人的相似性,研究果蝇心脏发育基因有助于揭示人体心脏发育机理和先天性心脏病发生机制.为了克隆和鉴定控制心脏发育的新基因,在化学诱变建立果蝇平衡致死系的基础上,用果蝇心脏组织特异抗体Mab No.3,对310个平衡致死系进行免疫化学方法筛选,观察到有63个致死系表现出心脏突变表型.分别将这些有心脏表型突变的品系与果蝇第2和第3染色体缺失系杂交,测定了14个品系的遗传学位点,其中7个品系在遗传学位点上有别于已报道的心脏发育控制基因.并查寻和讨论了各突变品系的可能侯选基因.
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小分子RNA在先天性心脏病中的研究进展
小分子RNA（miRNAs）是一类在转录后水平调控基因表达的小分子非编码RNA。它们具有进化保守性、组织细胞特异性和核酸杂交高度特异性。miRNAs在心肌细胞的增殖、分化和凋亡、心脏神经嵴细胞的迁移、心脏形态发生和心脏图式发育等诸多过程中扮演着重要角色，可为先天性心脏病发生机制的阐明提供一种全新的视角。miRNAs在先天性心脏病发生机制中的研究可分为临床研究和动物研究两类，该文就这两类研究的研究进展及其研究结论对先天性心脏病机制的阐释以及目前国内研究的现状和局限等方面进行综述。
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心脏营养素-1与心血管疾病的关系
心脏营养素-1(cardiotrophin-1, CT-1)是Pennica[1]等于1995年利用鼠胚胎干细胞模型克隆的一种促心肌细胞肥大因子,属于IL-6家族/糖蛋白130受体偶联的细胞因子家族[2],发现其不但在心脏发育和促心肌细胞肥大中有重要作用,且能拮抗心肌损伤,对周围血管有扩张作用,为一参与心血管疾病发生与发展的重要细胞因子,本文现将其研究成果综述如下.
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组蛋白H3K9ac乙酰化与H3K9me3甲基化修饰对小鼠心脏发育的交互调控作用
目的 探讨组蛋白乙酰化和甲基化修饰对心脏发育的交互调控作用,为先天性心脏病的防治提供新的理论基础.方法 将24只昆明孕小鼠随机分为胚胎14.5 d(ED 14.5)组、胚胎16.5d (ED 16.5)组、新生0.5 d(PND 0.5)组及新生7d (PND 7)组,采集各组胎鼠及新生小鼠心脏,每组检测标本数为6.运用比色法检测心肌组织组蛋白乙酰化酶(HATs)及组蛋白甲基转移酶(HMTs)活性;Western blot法检测心肌组织组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)及组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化(H3K9me3)表达水平.结果 比色法结果表明:HATs和HMTs活性在出生前均呈现高表达,出生后均呈现低表达;且PND 0.5和PND7时小鼠心肌组织HATs活性与ED 14.5时相比,以及PND 7时小鼠心肌组织HATs活性与ED 16.5时相比差异均有统计学意义(P＜0.05);小鼠心肌组织HMTs活性在PND 7时与ED 14.5和ED 16.5时相比差异有统计学意义(P＜0.05).Westemblot结果显示:组蛋白H3K9ac和H3K9me3在出生前呈现高表达,出生后呈现低表达,且PND 0.5和PND 7时小鼠心肌组织组蛋白H3K9ac和H3K9me3分别与ED 14.5和ED 16.5时相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在心脏发育过程中HATs、HMTs及组蛋白H3K9ac、H3K9me3呈现动态表达,提示HATs和HMTs介导的组蛋白H3K9ac乙酰化及H3K9me3甲基化修饰在心脏发育过程中可能发挥了交互调控作用.
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组蛋白乙酰化酶对心脏发育核心转录因子Mef2c的动态调控作用
目的 观察心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶P300、PCAF、SRC1对心脏发育核心转录因子Mef2c的动态修饰作用,为明确先天性心脏病的发生机制奠定基础.方法 选取胎龄14.5 d和16.5 d胎鼠及生后0.5 d和7d小鼠的正常心脏组织,采用染色质免疫共沉淀技术,运用抗P300、PCAF、SRC1、乙酰化组蛋白(ac-H3)抗体免疫沉淀与其相结合的DNA,Real-Time-PCR扩增抗体所富集的DNA,观察小鼠心脏发育过程中Mef2c启动子区域组蛋白乙酰化酶的动态修饰及ac-H3水平;同时运用Real-Time-PCR检测Mef2c mRNA表达量.结果 小鼠心脏发育过程中P300、PCAF、SRC1均参与Mef2c启动子区域的乙酰化修饰,其结合水平在心脏发育的不同阶段差异均有统计学意义(均P＜0.01).Mef2c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平及Mef2c基因mRNA表达水平在心脏发育的不同阶段差异均有统计学意义(均P＜0.01).ac-H3、Mef2c mRNA及3种组蛋白乙酰化酶表达水平均具有一定时序性,即在胎龄14.5 d时,上述指标水平均明显高于其他时间点(均P＜0.01),且随心脏的发育成熟表达水平均逐渐降低,至出生后均维持在低表达水平.结论 小鼠心脏发育过程中Mef2c基因呈现动态表达,提示Mef2c基因在心脏发育中具有重要作用;同时Mef2c启动子区域乙酰化水平的变化受组蛋白乙酰化酶P300、PCAF、SRC1的动态调控.
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叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2b HAS2 表达下调
目的 该研究利用叶酸拮抗剂甲氨喋呤(MTX)构建叶酸生物学活性受抑制的斑马鱼模型后,观察叶酸生物学活性受抑后对斑马鱼心脏发育的干扰作用以及对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响.方法 用不同浓度的MTX处理不同发育时段的斑马鱼胚胎,于48 hpf(hours post fertilization)观察胚胎心脏发育情况并计数各组心脏发育异常个体的百分比及心率,评定MTX对斑马鱼心脏发育的影响程度.用1.5×10-3M的MTX处理6～10 hpf发育时段的斑马鱼胚胎作为MTX处理组.于24 hpf及48 hpf在显微镜下观察MTX处理组斑马鱼胚胎心脏发育情况.借助胚胎整体原位杂交和Real-time PCR的方法检测BMP2b和HAS2在正常对照组及MTX处理组胚胎的表达水平.结果 胚胎早期发育阶段6～12hpf是斑马鱼胚胎对MTX的敏感时期.显微镜下观察结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育延迟,并有心脏形态发育明显异常.胚胎整体原位杂交结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2在心脏的表达于36 hpf及48 hpf下调.Real-time PCR结果显示MTX处理组斑马鱼BMP2b的相对表达量在12,24,36及48 hpf减少,HAS2的相对表达量在24,36及48 hpf减少.结论 叶酸生物学活性受抑对早期胚胎的心脏发育影响较大,可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常,并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达,这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一.
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人类心脏发育候选基因KLHL31RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定
目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类心脏发育候选基因KLHL31表达的pSUPER RNAi载体( pSUPER-KLHL31).方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向心脏发育候选基因KLHL31的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER -KLHL31),通过酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.通过Western blotting检测转染pSUPER-KLHL31后细胞中KLHL31蛋白的表达量.结果:pSUPER-KLHL31载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,且序列完全一致；重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功；Western blotting检测结果显示转染pSUPER -KLHL31的细胞中KLHL31蛋白表达量明显降低.结论:靶向KLHL31的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨KLHL31在心脏发育中的功能奠定了基础.
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孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响
目的 探讨孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及分子机制.方法 将24只怀孕SD母鼠随机分为4组:正常对照组、10支烟/d组、20支烟/d组、40支烟/d组,每组6只,并于孕期0.5 d(GD 0.5)后开始给予吸烟处理直至分娩.采用超声多普勒Vevo2000检测出生后1d的新生乳鼠的左心结构及其心脏功能;采用Color-Doppler检测心室血流方向,以确认室间隔的发育是否异常.心功能检测完毕后,收集各组新生乳鼠心脏组织,采用Western-blot检测心肌特异转录因子GATA4的表达量.结果 各组新生乳鼠心脏重量无明显差异,40支烟/d处理组乳鼠体重显著下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.001).孕期持续给予40支烟/d被动吸烟处理能显著降低左心室重量、左心室舒张/收缩末期前壁厚度和左心室舒张/收缩末期后壁厚度,差异均有统计学意义(P＜0.05).孕期给予20支烟/d和40支烟/d处理后,新生乳鼠的GATA4蛋白表达呈剂量依赖性下调,40支烟/d组与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 母鼠在怀孕期间接受被动吸烟后,引发后代新生乳鼠的心功能受损,其机制可能与下调心肌特异转录因子GATA4表达相关.
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长链非编码 RNA 对心脏发育的表观遗传学调控研究进展
长链非编码RNA （ long noncoding RNA or large noncoding RNA， lncRNAs ）是一类转录本长度超过200 nt的功能性RNA，存在于细胞核或胞质中。 ln－cRNAs能调节生命过程中关键基因的表达，从而影响机体正常生理发育、功能维持和异常病理过程，如神经干细胞分化发育、心脏疾病发生、肿瘤形成等［1］。 lncRNAs是继miRNAs之后的又一重要调节性非编码RNA。已有研究表明， lncRNAs能够与染色质修饰蛋白、DNA或miRNAs等核酸形成复合物，在表观遗传、转录和转录后多个层次调控心脏发育基因的表达，其中表观遗传学调控是近几年的研究热点。本文从心脏发育和心脏疾病两方面综述ln－cRNAs在心脏发育稳态中的新研究进展及其表观遗传学调控机制。
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CT-1对心血管系统的生物学效应与心脏重塑的关系
心脏营养素-1(Cardiotrophin-1,CT1)是Pennica D.等[1]于1995年首次用胚胎干细胞建立体外心脏发育的模型,再用克隆表达的方法从培养6 d的大鼠囊胚体中分离出来的一个分子量为21.5kDa的蛋白质,它具有很强的促进培养的心肌细胞肥大的作用,故而称之为心脏营养素.近年来,其与心血管系统疾病的关系已越来越引为重视.现综述如下.
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Nkx2.5在妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育中的表达及意义
目的：了解心肌转录因子 Nkx2.5在妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）胎鼠心肌组织的表达变化，探讨其在妊娠期糖尿病胚胎心脏发育异常中可能的作用机制。方法：80只成年雌性 SD大鼠，随机分为实验组（GDM 组）和对照组各40只，实验组通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）成功建立妊娠期糖尿病大鼠模型后，两组分别于孕12、15、19d 随机分组并行剖腹产，取胎鼠心肌组织。采用免疫组织化学及实时荧光定量 PCR 检测 Nkx2.5蛋白及 mRNA 在胎鼠心肌组织的表达。结果：对照组与实验组 Nkx2.5蛋白及 mRNA 在胎鼠心肌组织的表达随胎龄的增长而呈上升趋势，同一时间点实验组 Nkx2.5蛋白表达较对照组明显减少，差异有统计学意义（P﹤0.01）；孕12及19 d 实验组 Nkx2.5mRNA表达较对照组明显减少，差异有统计学意义（P﹤0.01），孕15 d 两组间无明显差异。结论：Nkx2.5蛋白及mRNA 在妊娠期糖尿病胎鼠心肌组织的表达下降，可能参与了妊娠期糖尿病致胚胎先天性心脏病的发病过程。
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miRNA在冠心病临床应用中的研究进展
近年来,心脑血管疾病已经成为我国因病死亡的首位原因,其中冠心病占有非常大的比例,严重危胁着人们的身体健康[1].微小RNA(miRNA)是一种长度约为20~24个核苷酸的内源性小分子单链非编码RNA[2],几乎存在于所有的真核微生物中[3].miRNA在生物个体发育、细胞增殖、分化、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥着重要作用.近研究发现循环血中存在miRNA,它作为一种调节因子在心脏发育、血管发育、血管再生中起着重要作用[4].近年来有关miRNA在冠心病中作用的研究广受关注,大量研究表明,miRNA将作为一种新型的生物标记物在冠心病患者的诊断和预后中发挥重要的作用[5],并且有望成为冠心病的一个新型治疗靶点[6].
