首页 > 文献资料
-
肾综合征出血热灭活疫苗大鼠效力试验模型
目前肾综合征出血热灭活疫苗效力试验采用家兔作为免疫动物,对疫苗免疫能产生较好的中和抗体和免疫荧光法(IFA)抗体应答,但购买和饲养家兔成本较高.实验用大鼠为汉坦病毒的敏感动物,我们已经报道汉滩病毒(HTNV)型(Ⅰ型)肾综合征出血热灭活疫苗免疫大鼠,观察表明大鼠对Ⅰ型疫苗的反应性良好,同型中和抗体应答类似于家兔,异型中和抗体和IFA抗体应答较家兔为好.我们继续研究汉城病毒(SEOV)型(Ⅱ型)和双价肾综合征出血热灭活疫苗在大鼠的免疫反应,并观察了疫苗的稳定性.
-
精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察
目的 以Vero细胞为基质，研制新一代精制Vero细胞狂犬病疫苗。 方法 以CTN-1V10为生产毒株，以＜150代Vero细胞为培养基质， 采用转瓶旋转培养，按不同时间收获病毒液，经过澄清、浓缩、纯化、灭活制成精制Vero 细胞狂犬病疫苗。从以此工艺制备的疫苗中选取一批做为免疫学效果观察的受试疫苗。按暴 露后免疫程序接种63人，其中受试疫苗接种33人，法国维尔博狂犬病疫苗接种30人，观察不 良反应和测定中和抗体。结果 新研制的精制Vero细胞狂犬病疫苗 各项指标完全符合WHO的有关质量要求。两种疫苗全程免疫后中和抗体阳转率均为100%，中 和抗体受试组为11.94 IU/ml;维尔博疫苗对照组为11.69 IU/ml。结论 精制Vero细胞狂犬病疫苗不但制造工艺合理，而且副反应轻微，免疫原性 良好。
-
利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体
以细胞法从HIV-1 CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体.将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2_NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性.四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920).这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位.我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1 CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24 μg/mL、0.89 μg/mL和3.09μg/mL.其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69 μg/mL 和3.52 μg/mL.提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体.因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台.
-
家养犬、猫及野生动物中狂犬病病毒流行病学调查及我国不同类型狂犬病疫苗免疫效果观测研究
选择我国狂犬病高发地区(湖南、贵州)、低发地区(江苏、武汉)和无狂犬病报告地区(沈阳)等三种不同类型的地区,开展针对家养犬、猫和啮齿类动物,以及蝙蝠等野生动物的狂犬病病毒带毒率的流行病学调查,对分离到的病毒株在抗原型别、基因变异以及与现行疫苗是否匹配等方面进行分析、比较研究.结果显示:我国狂犬病的主要宿主动物为犬,捕获犬总带毒率为2.56%;犬中狂犬病病毒的监测点高阳性检出率达到20.0%;啮齿类动物及蝙蝠等野生动物在本次研究未检测到狂犬病病毒.我国自主研制成功的以aG株和CTN株为毒种的现行人用狂犬病疫苗,经应用研究发现,CTN株的糖蛋白基因与本研究分离到的街毒核酸序列更接近.为进一步评价现行疫苗的有效性,在5个观察点分别以aG株和CTN株毒种生产的疫苗接种两组人群(每组各约50人),结果显示均未出现中、强度反应,疫苗免疫后第7d和14d产生的中和抗体分别达到0.49IU/mL～0.52IU/mL和6.7IU/mL～7.53IU/mL;抗体阳转率分别为45.1%～47.9%和100%,表明这些疫苗具有良好的安全性和保护效果.
-
新型肠道病毒A71、A90和B87型血清流行病学调查
为了解山东省人群中新型肠道病毒(EV)A71、A90和B87型抗体水平及自然感染状况,以便为制订相关防控措施提供依据,本研究利用2010年在山东省烟台市各年龄组健康人群中采集到的血清样本400份,采用中和试验检测EV-A71、A90和B87抗体水平,并对检测结果进行统计学分析.结果表明,调查人群EV-A71、A90和B87型中和抗体阳性率分别为46.0％、8.8％和47.0％,抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶5.20、1∶1.49和1∶4.02.EV-A71抗体阳性率在“1岁～”年龄组儿童中低,EV-B87在“7月～”年龄组儿童中低,之后逐渐升高,5岁以上儿童抗体阳性率较为一致.EV-A90各年龄组人群抗体阳性率较为一致.由此推测,EV-A71母传抗体水平出生后迅速下降,感染可能主要发生于3～7岁的幼儿园及低年级儿童.健康人群,尤其是儿童中EV-B87抗体阳性率较高,人群中可能存在一定的免疫屏障.人群中EV-A90抗体阳性率较低,需要对其加强监测.
-
中国猕猴预存抗腺病毒中和抗体滴度对腺病毒体外感染单核细胞效率的影响
为了探索通过血液系统利用重组腺病毒载体的方法,以中国猕猴为动物模型,以复制缺陷型人5型腺病毒(human adenovirus serotype 5,HAd5)为载体携带报告基因在体外直接感染外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC).首先对HAd5在体外感染PBMC的条件进行优化,证实离心力可提高HAd5的感染效率;细胞分群结果表明HAd5特异感染PBMC中的CD14+单核细胞,仅感染小部分自然杀伤细胞,但几乎不感染T淋巴细胞和B淋巴细胞.首次发现:猕猴体内预先存在的抗HAd5中和抗体滴度越高,其单核细胞在体外对HAd5的易感性越强.这种现象将拓宽基于腺病毒载体的基因治疗和疫苗的临床应用范围,尤其是对预先存在腺病毒中和抗体的人群更具意义,为探索更方便有效的基因治疗和疫苗研究带来新的思考.
-
三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究
本研究构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒,间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达.三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR'CMV△8.2及携带EGFP报告基因的自灭活(Self-Inactivating,SIN)转移质粒pCS-CG共转染293FT细胞,产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型(pseudotyped)病毒颗粒,免疫荧光与Western blot分析验证了E1/E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺人,利用p24 ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定.从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81(且后者上的感染效率约为前者上的2～3倍);利用针对HCV E2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33建立了基于上述假病毒颗粒的丙肝病毒体外中和抗体滴定方法,并应用于丙型肝炎患者体内的中和抗体水平的研究.本研究成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒并建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法,为研究HCV感染早期特性及特异抗病毒药物的体外筛选提供了有效模型,并可用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析.
-
深圳市首例人感染H5N1病毒病例的实验室诊断及分子特点分析
对深圳首例疑似人禽流感病人的标本,进行了RT-PCR、Real-time PCR检测及病毒分离培养、血清中和试验、抗原比检测及发病早期不同病程多份标本的病毒载量分析;对分离物进行了HA基因、NA基因及M基因的核酸检测.结果表明:患者气管吸出物的H5N1亚型和A型流感病毒的特异核酸均呈阳性,并通过细胞培养分离到禽流感病毒A/Guangdong/2/06(H5N1)株.气管吸取物病毒载量随着病程延长逐渐减少,而血清中和抗体水平逐渐上升达到1∶160之后又缓缓下降.A/Guangdong/2/06株8个片段的核苷酸序列显示,其与2005～2006年中国南部的禽流感分离株高度同源,与越南、泰国、印度尼西亚等分离到的禽流感分离株存在明显的差异.
-
用于狂犬病单克隆抗体中和活性检测病毒库的制备及初步应用
以狂犬病街毒株为攻击病毒建立检测狂犬病单克隆抗体中和活性的方法.小鼠脑内接种分离扩增狂犬病阳性标本24株;分离到的街毒株在N2A细胞进行培养及病毒滴度测定,选择能够适应N2A细胞生长且滴度较高的街毒株建立病毒库;建立方法后对TRN006单克隆抗体进行3次检测,评价其重复性.24份狂犬病阳性标本均分离成功;只有15株病毒能够适应N2A细胞,并在细胞上形成荧光灶;终选取10株滴度较高病毒建立病毒库,该病毒库覆盖了中国9个不同省份及四个中国毒株群;用其中三种病毒对狂犬病单克隆抗体进行中和活性检测3次,T检验发现其具有良好的重复性.
-
抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究
以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型,对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究.单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断.这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内.Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合.这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体.这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具.
-
人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆虫细胞中的表达
将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特异性单抗G10 Fab的基因,克隆入杆状病毒入源IgG抗体表达载体,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体G10.用亲和层析的方法纯化了表达产物,经与一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白,亲和力约为10-9M.体外中和实验证明,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性.
-
柯萨奇病毒A组16型灭活抗原对小鼠免疫保护作用的研究
为了研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)灭活抗原在小鼠体内所产生免疫保护作用效果,我们选用CVA16临床分离株521-01T,在Vero细胞中进行大量培养,并对培养产物进行甲醛灭活及超速离心纯化.SDS-PAGE和Western blot对纯化的灭活病毒纯度及性质进行初步分析.Al(OH)3+CVA16及单独CVA16抗原,分别经皮下注射免疫雌性ICR小鼠;相同免疫途径、剂量于第14和28 d加强免疫2次.ELISA法检测CVA16特异性血清IgG抗体滴度;微量中和试验法鉴定血清中和抗体滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化.对Al(OH)3+CVA16抗原免疫组母鼠所产仔鼠进行脑腔攻毒,检测母传抗体对新生乳鼠的保护作用.结果显示,Al(OH)3+CVA16灭活抗原在小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,3次免疫后产生的特异性血清IgG抗体滴度高可达1∶1×105 (P=0.000),中和滴度高于1∶256.同时,该抗原还可以诱导特异性T淋巴细胞的活化.以1 000 LD50的病毒量脑腔接种48h内新生乳鼠的病毒攻击实验显示,该母传抗体对新生乳鼠具有100％的保护.这一结果表明该灭活CVA16病毒抗原具有较好的免疫原性及保护性,为CVA16灭活疫苗的研究及评价体系提供了参考.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 灭活疫苗 中和抗体 免疫保护 -
Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定
登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多.我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位.采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第309～320位和第381～392位(Amino acid residues 309～320,and 381～392;aa 309～320和381～392).Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～ Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310KE-VAETQHGT"9,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性.DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1 E蛋白氨aa 381～392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守.我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第329～348位.这些新发现的DENV-1 E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗.
-
尼帕病毒进入抑制剂研究进展
尼帕病毒(Nipah virus)属副粘病毒科亨尼帕病毒属,是在南亚各国出现的一种人畜共患病高致死率病毒.自1999年以来至少造成387人死亡,属生物安全4级病原(BSL-4),迄今为止尚无针对该病毒的疫苗或药物批准上市.近年来,以尼帕病毒进入宿主细胞为靶点的结合抑制剂和融合抑制剂是抗该病毒研究的重点,本文对此领域进行综述.
-
冠状病毒分子生物学研究进展
1 冠状病毒概述 冠状病毒属于冠状病毒科,是病毒中的一个大家族,因电镜下病毒颗粒形似王冠而得名.形态为圆形、椭圆形或轻度多形性,直径为100nm～120nm.人冠状病毒有两个血清型,即HcoV-229E和HcoV-OC43,是人呼吸道感染的重要病原,人类20%的普通感冒由冠状病毒引起[1].儿童的冠状病毒感染并不常见,但是5～9岁儿童有50%可检出中和抗体,成人中70%中和抗体阳性.冠状病毒也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病因之一.由于冠状病毒易于变异,同一株病毒可重复感染人体.冠状病毒具有严格的宿主特异性,只感染自然宿主或亲缘关系密切的宿主.冠状病毒感染广泛分布于全世界各地,主要发生在冬春季节.
-
重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察
为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.
-
重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体
为研究重组病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP和HPV-6 L1+L2 VLP免疫BALB/c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用.VLP诱导了高滴度(＞1∶10 000)的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮组织的感染.重组HPV-6 VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用.提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗.
-
免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究
将传染性法氏囊病病毒(IBDV)ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因插入pCI质粒的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达.以免疫刺激复合物(ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验.结果表明:以肌内和皮内联合免疫法效果好,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫.与常规的弱毒疫苗B87和D78相比,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低,对强毒攻击的保护率相当.本试验还证实,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用.DNA疫苗能诱导产生保护性反应,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径.
-
SARS灭活病毒免疫兔后IgG特异抗体应答
将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次 ,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化.免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清.间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性.第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1:51 200、1:49 600、1:25 600;中和试验测得G1组第28 天血清样品中和抗体效价为1:2 560;蛋白芯片测得M、N、3CL、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体 ,但是不同蛋白抗原结合能力有差别.因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体.
-
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白N端信号肽对其DNA免疫应答的影响
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要病原之一,可引起繁殖母猪流产和新生仔猪呼吸道疾病[1,2].该病毒属于动脉炎病毒科,有美洲型和欧洲型两种血清型.基因组为单股正链RNA,大小15kb左右,含有9个开放阅读框(ORF)[3].由ORF5、6和7编码的GP5、M和N蛋白是病毒的主要结构蛋白.
