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1型糖尿病小鼠胰岛胰岛淀粉样多肽和生长抑素阳性细胞表达的改变
目的：探讨1型糖尿病（T1DM）小鼠胰岛表达胰岛淀粉样多肽（IAPP）、生长抑素（SS）的改变及可能的机制。方法取正常C57BL／6J小鼠，小剂量多次注射链脲菌素（STZ）建立1型糖尿病小鼠模型，分别于第3、7、10、14、21、28天取胰尾组织，通过免疫组织化学SABC法、激光扫描共焦显微镜免疫荧光检测法及图像分析、形态计量法进行研究。结果1．IAPP阳性细胞面数密度（NA）自第3天开始减少（P＜0．05），平均吸光度自第7天开始增高，与正常及生理盐水对照组比较差异具有显著性（ P＜0．05）；2．1型糖尿病组小鼠胰岛SS阳性细胞NA自第3天开始增加（P＜0．05），平均吸光度自第7天开始增高（P＜0．05）；3．免疫荧光双染法显示，小鼠胰岛IAPP和SS在部分细胞有共表达。结论1型糖尿病小鼠胰岛IAPP阳性细胞数目减少，表达增强；SS阳性细胞数量及表达均上调；IAPP和SS在部分细胞有共表达。提示IAPP阳性细胞和SS阳性细胞均参与了1型糖尿病的病变过程。
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新生大鼠心祖细胞原代分离培养及鉴定
目的 原代分离培养及鉴定新生大鼠心祖细胞(CPCs).方法 利用差速贴壁原代分离培养CPCs,形态观察和二乙酸羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)示踪法检测细胞增殖.使用Fluo-3/AM钙离子检测法,检测集落增殖细胞中钙离子浓度变化.免疫荧光技术检测集落增殖细胞的干细胞标记物及心肌细胞标记物的表达.结果 差速贴壁法获得细胞培养1周左右即观察到集落增殖的细胞,圆/椭圆形或不规则多边形细胞呈铺路石样排列.随培养时间延长,细胞集落增大.培养3周左右,细胞集落中细胞形态发生改变(分化),逐渐出现突起或呈梭形等,集落中出现波动/跳动的心肌细胞.用CFDA SE示踪显示,细胞呈集落增殖特点;Fluo-3/AM钙离子检测显示,集落增殖细胞中分化细胞的钙离子浓度增高.免疫荧光检测显示,不同的集落增殖细胞具异质性,存在c-kit+/CD34-、Nanog +/CD34-和c-kit-/Nanog-细胞集落;增殖的细胞集落存在c-kit和Gata4阳性共表达,随细胞分化出现心肌肌钙蛋白T(cTnT)细胞集落.结论 差速贴壁法原代分离培养的心祖细胞具有集落增殖和分化为心肌细胞的能力,是研究心祖细胞表面标记物、增殖和调控机制的理想材料.
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Id2从核迁移到细胞质后通过调节凋亡诱导因子表达促进骨骼肌细胞分化
目的 探讨Id2在骨骼肌再生中的作用机制.方法 用绿色荧光蛋白(GFP)-Id2-C2表达载体转染C2C12成肌细胞,对转染组和非转染组进行H2O2处理和2%马血清处理,用RT-PCR法观察两组细胞Id2基因表达的差异;Western blotting观察两组细胞的成肌分化相关蛋白的表达情况;免疫荧光显微镜观察正常组、纤维损伤组以及去神经支配组大鼠的骨骼肌中Id2和凋亡诱导因子(AIF)蛋白的表达情况.结果 与非转染组相比,Id2转染组细胞成肌分化明显增强.免疫荧光染色法显示,50μmol/L H2O2能增加核Id2蛋白的表达.在氧化应激条件下,Id2能抑制成肌调节因子(MyoD)而活化肌浆蛋白(myogenin).2%马血清能引起大多数Id2从细胞核迁移到细胞质,从而抑制活性氧(ROS)诱导的线粒体AIF表达.免疫荧光分析显示,去神经支配组大鼠的骨骼肌中细胞内的Id2和AIF蛋白表达增多.结论 Id2从细胞核迁移到细胞质后能促进骨骼肌细胞分化,其作用与AIF表达水平相关.
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rhG-CSF促进体外培养神经干细胞的增殖
目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对小鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖的作用.方法 分离培养小鼠NSCs,通过向培养基中添加G-CSF(10、30、60、100和200μg/L),四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法以及5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU) 免疫荧光染色标记检测NSCs的增殖.免疫印迹法检测NSCs增殖时信号转导与转录激活因子3(STAT3)和磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)的表达.结果 神经干细胞表达G-CSF受体,细胞活性随G-CSF的浓度不同表现出一定的剂量依赖性,当G-CSF的浓度为100μg/L时细胞的活性高.G-CSF处理组的细胞增殖活性明显高于对照组.进一步证实,在G-CSF处理后,p-STAT3的表达则在5 min开始升高,30 min 到达峰值,之后开始下降,至75 min 接近正常水平.加入G-CSF受体的抗体后,p-STAT3的活化现象消失,并且细胞的增殖也明显低于G-CSF作用组,和对照组接近.结论 rhG-CSF可促进小鼠NSCs的增殖,其作用机制可能是通过细胞表面的G-CSF-R促进STAT3的活化.G-CSF可能作用于内源性NSCs的活化和增殖.
关键词： 重组人粒细胞集落刺激因子 神经干细胞 信号转导与转录激活因子3 免疫荧光 免疫印迹法 小鼠 -
Nanog蛋白在CD73+小鼠脂肪源间充质干细胞中的表达
目的 探讨Nanog蛋白在小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)中的表达规律.方法 体外分离培养ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73 -两个细胞亚群.体外分别培养两组细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光测定两组细胞Nanog蛋白的表达,并比较其差异.结果 CD73+ ADMSCs细胞约占总细胞的5％,形态上分为大细胞和小细胞.Nanog蛋白在CD73+ ADMSCs细胞中强阳性表达率(16.85±6.83)％,弱阳性表达率(81.78 ±7.19)％,阴性表达率(1.63±3.59)％；nanog蛋白在CD73 - ADMSCs细胞中强阳性表达率(5.74±2.79)％,弱阳性表达率(85.84 +37.31)％,阴性表达率(8.42±4.12)％.在Nanog阳性表达的细胞中可见不同分裂时相的有丝分裂细胞,CD73+细胞的分裂象明显多于CD73 -细胞.结论 CD73和Nanog可能均是ADMSCs特异性表达的标志,Nanog蛋白强阳性的细胞可能更具幼稚性.通常采用分离培养方法获得的ADMSCs是多种细胞的复合物.
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β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用
目的 运用Tet-on3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘于细胞(LSCs)的作用.方法 将pLVX-TRE3 G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293 FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000 μg/L Dox诱导表达组).48 h后收集细胞,免疫印迹法(Westernblotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况.体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、TrkA)的表达情况.结果 NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,TrkA表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,TrkA表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 运用Tet-on3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性.
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新生大鼠多器官成纤维细胞nanog蛋白的表达差异
目的 探讨新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤中成纤维细胞nanog蛋白表达差异及其意义.方法 用免疫组织化学、免疫荧光和体外细胞培养技术,对成纤维细胞进行nanog蛋白和波形蛋白(vimentin)标记,检测并比较新生大鼠不同器官中成纤维细胞nanog蛋白和vimentin表达及共表达特征.结果 新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤6种器官中均有nanog蛋白和vimentin表达,在每个器官中均有少数成纤维细胞共表达这两种蛋白,共表达率分别为心(10.07±0.77)％、肝(9.97±3.70)％、脾(11.23±2.98)％、肺(15.07±2.87)％、肾(11.75±2.76)％、皮肤(16.14±1.28)％,其中皮肤和肺的共表达率高于心、肝、脾、肾(P＜0.05).结论 共表达nanog蛋白和vimentin的成纤维细胞可能更具有干细胞样特性;新生大鼠皮肤和肺的成纤维细胞可能更具有组织损伤修复潜能.
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刺梨黄酮对阿霉素所致心肌细胞毒性的保护作用
目的 探讨刺梨黄酮(FRRT)对阿霉素(DOX)所致心肌细胞凋亡的影响及机制.方法 利用1～3d新生大鼠(每次26只)原代分离培养心肌细胞和H9C2心肌细胞系,5μmol/L DOX孵育心肌细胞,建立心肌细胞毒性模型,并用FRRT干预,透射电子显微镜观察各组H9C2心肌细胞株超微结构.利用免疫荧光技术和Western blotting检测Bax、P53和Bcl-2蛋白的表达,并对Western blotting检测结果进行半定量分析.结果 透射电子显微镜观察显示,DOX组细胞内呈现大量的自噬泡和脂褐素,细胞状态差;FRRT干预后,心肌细胞未见脂褐素的结构,有少量自噬泡.免疫荧光检测显示,DOX组Bax和P53呈阳性表达,Bcl-2呈弱阳性表达;FRRT+DOX组Bax和P53表达不明显,Bcl-2呈强阳性表达.Western blotting检测结果显示,5μmoL/L DOX孵育心肌细胞18h时,Bax蛋白表达水平达到高,组间比较,差异有统计学意义(*P＜0.01).Bax蛋白在DOX组表达增加,FRRT+DOX组表达减少,组间比较,差异具有统计学意义(*P＜0.05);P53蛋白在DOX组表达增加,FRRT+DOX组表达减少,组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);Bcl-2蛋白在DOX组表达减少,FRRT+DOX组表达增加,组间比较,差异具有统计学意义(*P＜0.05,**P＜0.01).结论 FRRT通过下调DOX引起的心肌细胞凋亡作用,进而发挥对心肌细胞的保护作用.
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何首乌饮对衰老大鼠生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响
目的 探讨何首乌饮对衰老大鼠睾丸生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响.方法 选用12月龄Wistar雄鼠45只,随机分为3组:青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组,每组15只,何首乌饮组和自然衰老组于16个月开始分别灌胃何首乌饮和等量蒸馏水,连续60d.青年对照组于12月龄,其余两组于18月龄分别进行实验,通过Real-time PCR、免疫荧光染色和免疫印迹法,观察各组大鼠睾丸组织线粒体凋亡通路关键基因DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C、14-3-3σ的表达变化.结果 自然衰老大鼠线粒体凋亡通路关键基因14-3-3σ表达明显低于青年对照组,DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C表达明显高于青年对照组;而何首乌饮用药后能明显逆转上述现象.结论 何首乌饮提高衰老大鼠精子质量与线粒体凋亡通路有关.
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小鼠晶状体发育过程中细胞增殖及突触素蛋白的表达
目的 探讨小鼠晶状体细胞增殖、细胞周期蛋白(cyclin) D1和突触素(SYN)的表达情况.方法 各日龄小鼠共150只,HE染色和4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,在光镜下观察小鼠晶状体的一般结构；用抗细胞增殖核抗原(PCNA)免疫荧光法以及5'-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)技术标记晶状体增殖细胞；用免疫荧标记标价法检测细胞周期蛋白cyclin D1和SYN在晶状体的表达.结果 孕8d(E8)左右,晶状体由初的晶状体板分化而来,是由单层柱状上皮细胞围成的空泡,空泡再进一步分化,被原始晶状体纤维所替代,逐渐形成晶状体；BrdU和PCNA的阳性细胞主要分布在晶状体上皮细胞的前囊中央区,但出生10d(P10)以后BrdU阳性细胞已不在晶状体上皮细胞分布,而PCNA持续表达.Cyclin D1阳性细胞在胚胎期主要在晶状体上皮细胞的赤道部表达,出生早期在晶状体上皮细胞的前囊中央区,出生5d(P5)以后在赤道前区分布,赤道部有少量阳性细胞；在晶状体发育过程中,SYN可以在晶状体基质中和赤道部胞体中发现.结论 细胞增殖对晶状体的发育和修复起着重要的作用；cyclin D1可能参与调控赤道部细胞的消失,因此保持晶状体的透明度；SYN在晶状体的表达说明了它对晶状体的透明有着重要的作用,通过调控钙离子内流入胞体和基质中.
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小鼠神经母细胞瘤细胞中神经型钙黏蛋白超表达对突起形成及连环蛋白表达的影响
目的 探讨神经型钙黏蛋白(N-cadherin)调控连环蛋白(catenin)对小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)形态的影响.方法 构建鼠源的N-cadherin融合蛋白超表达载体,利用脂质体转染的方法将空载体pCAG-MCS-EGFP和超表达载体pCAG-N-Cad-EGFP分别转染至N2a细胞,作为对照组和实验组;细胞划痕和黏附实验检测N-cadherin超表达对N2a细胞迁移和黏附的影响,免疫荧光检测N-cadherin超表达对N2a细胞形态的影响,并结合Western blotting检测连环蛋白家族的表达情况.结果 与对照组相比,N-cadherin超表达促进细胞突起的形成,使得N2a细胞突起增多和伸长;N-cadherin超表达增强了黏附性而抑制了细胞的迁移能力;N-cadherin超表达使得细胞内连环蛋白家族中α-catenin、β-catenin和p120蛋白表达均显著上升(P＜0.05),而γ-catenin表达下降但差异不显著(P＞0.05);另外,N-cadherin超表达的细胞有明显的聚集现象.结论 N-cadherin超表达促进N2a细胞突起形成,增强细胞的黏附性从而抑制细胞的迁移能力,调控连环蛋白家族成员的表达并促使细胞聚集.
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小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系
目的 探讨呼吸内胚层与咽前间充质细胞发育的关系及对小鼠胚胎心流出道分隔的影响. 方法 45只胚龄8～13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,用抗胰岛因子1(ISL-1)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗音猬因子(音速波状蛋白,Shh)、抗patched(Ptc1)、抗patched 2(Ptc2)、抗smoothened(Smo)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色. 结果 胚龄8～9d,ISL-1阳性细胞分布在心包腔背侧壁及前肠两侧间充质,并延伸至原始心管动脉端,心管心肌显较强的Ptc1和Ptc2阳性表达.胚龄10 ～ 13d,呼吸内胚层向腹侧延伸,Ptc1和Ptc2呈较强表达,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的特征性锥体形结构,经动脉囊背侧壁伸入动脉囊腔,形成主肺动脉隔.胚龄12d,主肺动脉隔ISL-1阳性表达基本消失,大部分细胞转变为α-SMA阳性细胞.结论 呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集密切耦联.发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过Shh信号通路对ISL-1阳性细胞的聚集提供位置信息.呼吸内胚层的正常腹侧延伸不但可诱导ISL-1阳性细胞的正常迁移和流出道的正常分隔,对流出道的正常形态发生及有效的肺循环建立起重要作用.
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小鼠胚胎呼吸内胚层相关第二生心区的发育
目的 探讨小鼠胚胎心流出道分隔过程中,前肠呼吸内胚层与咽前第二生心区细胞发育的形态学关系及机制.方法 胚龄9 ～ 13d小鼠胚胎标本各6例,连续石蜡切片,用抗转录因子叉头框蛋白A2(Foxa2)、抗胰岛因子1(ISL-1)、抗patched1(Ptc1)、抗patched 2(Ptc2)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色.结果 胚龄9～9.5d,前肠腹侧壁ISL-1阳性内胚层局部增厚,呼吸内胚层开始发育,ISL-1阳性间充质细胞紧随其后开始出现在呼吸内胚层周围的基质中.胚龄10 ～ 11.5d,呼吸内胚层向动脉囊方向生长延伸向喉-气管沟演变,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层呈对称的特征性锥体形结构分布,锥体顶端突人动脉囊腔向主-肺动脉隔发育.在喉-气管沟发育过程中,总能观察到1条实心内胚层细胞索位于其腹侧顶端,Ptc1和Ptc2主要局限于发育中的喉-气管沟及实心细胞索表达,喉一气管沟及实心细胞索的内胚层则位于锥体结构的中心.胚龄12 ～ 13d,在流出道水平前肠分隔形成气管,内胚层细胞索逐渐消失,气管上皮逐渐失去Ptc1和Ptc2表达,气管腹侧的ISL-1阳性间充质细胞密度明显减低,并逐渐停止向流出道添加,动脉囊分隔完成.结论 呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性第二生心区细胞的发育聚集密切耦联.音猬因子(SHH)信号系统在呼吸内胚层发育过程中活跃程度较高,发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过SHH信号通路诱导ISL-1阳性细胞的聚集,并通过内胚层生长延伸造成的机械牵拉力驱动ISL-1阳性细胞迁移,参与流出道正常形态发生.
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不同发育时段大鼠心肌组织中超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4阳性细胞的分布特征
目的 探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在不同发育时期大鼠心肌组织中各类细胞的表达规律,为进一步研究HCN4对心肌的作用提供形态学依据.方法 出生1d、1月、3月、6月健康SD大鼠各15只.取新鲜心脏,石蜡切片和冷冻切片,利用免疫组织化学和荧光技术观察不同发育时段大鼠心肌组织HCN4阳性细胞的表达分布情况及形态学特征.利用Western blotting技术观察左右心室HCN4的蛋白含量.结果 免疫组织化学和荧光染色结果显示,HCN4阳性细胞在出生后1d、1月、3月、6月的血管平滑肌细胞,心内膜和血管的内皮细胞,心外膜的间皮细胞、成纤维细胞,大量心房肌细胞和少量心室肌细胞、传导组织细胞均有表达,但不同部位的表达细胞数量不均;Western blotting结果显示,心室HCN4蛋白随着月龄的增加表达逐渐降低.结论 HCN4在大鼠心肌组织中的表达随年龄的增加逐渐下降,但增殖能力较强的细胞持续存在,提示HCN4可能对心肌组织中的多种细胞的生存起调控作用.
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异丙肾上腺素诱导大鼠左心室损伤区心肌细胞的自发再生
目的 探讨在异丙肾上腺素诱导的心肌缺血坏死大鼠模型中,干细胞标记物阳性细胞参与坏死区自发性再生.方法 按4mg/kg剂量连续皮下注射异丙肾上腺素7d,制备大鼠缺血坏死动物模型.通过形态学、免疫荧光和EdU示踪等技术,研究心肌缺血坏死区形态变化、干细胞和心肌细胞标记物表达和增殖细胞的特征.结果 组织病理学观察显示缺血坏死区限制在近心内膜的心肌组织,早期坏死区存在呈强嗜酸性圆/椭圆或细棒形细胞,超微结构显示细棒形细胞具幼稚心肌细胞特征;免疫荧光技术显示坏死区呈c-kit +/gata+细胞、CD34+/gata+细胞、CD34+/factorⅧ+细胞;EdU标记显示新增殖的细胞呈cTnl阳性.结论 C-kit、nanog和CD34阳性干细胞参与坏死区的修复,坏死区产生了幼稚的心肌细胞,CD34+干细胞参与坏死区微血管形成.
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转录因子Tbx3在小鼠胚胎第二生心区的表达规律
目的 探讨转录因子Tbx3在小鼠胚胎第二生心区(SHF)的时空表达模式,为其对SHF的调节作用提供形态学依据.方法 40只胚龄9～15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗胰岛素基因增强子结合蛋白l(ISL-1)抗体、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa(MLC2a)抗体、小鼠抗增殖细胞核抗体(PCNA)、抗Tbx3抗体进行免疫组织化学和免疫荧光双标染色.结果 胚龄9d,咽腹侧内胚层增厚,且表达Tbx3与SHF标记物ISL-1.胚龄10～12 d,咽腹侧间充质出现ISL-1阳性细胞并逐渐增多,部分细胞共表达Tbx3.动脉囊壁、心包腔背侧壁以及流出道远端壁也可见ISL-1表达,Tbx3在这些部位均呈阴性.心背侧间充质突(DMP)内可见ISL-1、Tbx3散在表达.胚龄13 ～ 15 d,DMP逐渐心肌化,同时可见Tbx3阳性细胞分布.结论 Tbx3在SHF的表达集中在咽腹侧间充质,可能参与调节SHF前体细胞的存在与增殖;但在后第二生心区(pSHF)的作用与在动脉端的SHF可能不同.
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Bcl-2在小鼠肾脏发生发育中的表达
目的 探讨小鼠肾脏发育过程中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达. 方法 选取胚龄16(E16d)、18d和出生后1d(P1d)、3、5、7d、14和21d的昆明小白鼠共54只,应用免疫组织化学技术并结合体视学分析方法,观察小鼠肾脏不同发育时期树脂切片上Bcl-2的表达. 结果 在小鼠肾脏发育过程中,Bcl-2的阳性表达主要出现在近端小管,从E18 d到P1 d,Bcl-2阳性表达肾小管面数密度的增长速度快,在P7d之后,Bcl-2阳性表达肾小管面数密度的增长速度的变化不大. 结论 在肾的早期发育过程中,Bcl-2主要影响了近端小管的存活或死亡.
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Pin1抑制剂对小鼠植入前胚体外发育的影响
目的 观察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制剂胡桃醌(Juglone)对小鼠植入前胚体外发育的影响.方法 免疫荧光染色观察不同发育阶段植入前胚中Pin1的分布;收集小鼠1-细胞胚,以KSOM培养液为对照组,以培养液中添加有不同浓度的Juglone为实验组,观察各组1-细胞胚体外发育情况;Real-time PCR检测体外发育2-细胞胚内干细胞转录因子(Sox2、Oct4 、c-Myc和Klf4)mRNA表达水平.结果 小鼠不同发育阶段植入前胚中都存在Pin1的表达,胞质和胞核内均有分布,且核内荧光着色明显比胞质强;10 μmol/L和25 μmol/L胡桃醌持续作用93h(注射人绒毛膜促性腺激素后27h ～ 120h)使1-细胞胚阻滞于2-细胞阶段,极少能过渡至4-细胞胚(P＜0.01).25μmol/L胡桃醌短时间作用18h(注射人绒毛膜促性腺激素后27～ 45h)同样使1-细胞胚发育阻滞于2-细胞胚(P ＜0.01);25μmol/L胡桃醌组2-细胞胚内Sox2 mRNA表达水平低于KSOM组(P＜0.05),而Klf4、c-Myc和Oct4 mRNA表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 小鼠1-细胞胚之后,Pin1主要定位在细胞核内,提示其可能参与细胞转录活动.且Pin1抑制剂(胡桃醌)能使2-细胞胚至4-细胞胚过渡率明显降低,并使干细胞转录因子Sox2 mRNA表达下调,提示Pin1在小鼠植入前胚早期发育阶段具有一定作用,其参与调控合子基因组激活与干细胞转录因子Sox2有关.
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鼠胚呼吸内胚层相关第二生心区发育中的上皮-间充质转化
目的 探讨上皮-间充质转化与鼠胚呼吸内胚层相关第二生心区发育的关系.方法 用免疫印迹法检测转化生长因子β2(TGF-β2)和转化生长因子β3(TGF-133)在胚龄9～14 d小鼠胚胎心脏的表达情况.另用叉头框蛋白A2(Foxa2)、胰岛因子1(ISL-1)、层黏连蛋白(LN)及上皮型钙黏蛋白(E-cad)抗体,对35例胚龄10 ～ 12 d小鼠胚胎心连续石蜡切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色.结果 TGF-β2和TGF-β3蛋白于胚龄10 ～ 12 d在小鼠胚胎心脏均有表达.在上述呼吸内胚层相关第二生心区发育的时间点,均可见ISL-1阳性呼吸内胚层与周围ISL-1阳性第二生心区间充质分界不清或混为一体的现象,同时伴有相应部位基底膜的断续状或者模糊不清状改变;尤其在胚龄11d和12d,部分呼吸内胚层或其实心细胞索细胞失去Foxa2表达,呈较强ISL-1表达,同时伴有基底膜的断裂或者缺失,E-cad表达减弱,细胞间隙出现,甚至从内胚层脱离,失去上皮细胞的顶-底极性.结论 TGF-β信号调节的上皮-间充质转化参与鼠胚呼吸内胚层相关第二生心区发育形成.
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核纤层蛋白A、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43表达与小鼠胚胎心发育
目的 探讨小鼠胚胎心脏工作心肌和传导系心肌在形态发生和分化过程中核纤层蛋白A(lamin A)、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达特点.方法 用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、抗胰岛因子1(ISL-1)、抗Cx43、抗lamin A和抗转录因子TBX3,对46只胚龄8 ～ 15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学及免疫荧光染色.结果 胚龄9d,TBX3在原始心管的表达集中在房室管壁.10d始,TBX3阳性的表达逐渐从房室管壁沿着静脉瓣延续至窦房结、右心房背侧壁和房间隔.胚龄12 ～ 13d,TBX3阳性表达结构构成了中枢传导系雏形,包括窦房结、左右静脉瓣、房间隔、房室管、房室结和房室束.Cx43首先在胚龄9d的左心室腹侧壁和部分小梁心肌出现弱阳性表达,随着发育,Cx43逐渐在TBX3阴性的心房、心室工作心肌表达.Lamin A首先出现在10d房室管心内膜垫间充质细胞和左心室部分小梁心肌,随后在右心室小梁心肌出现,至胚龄15d,心室和心房小梁心肌及房室瓣均可见lamin A阳性表达,但致密心肌和中枢传导系心肌持续呈阴性表达.结论 中枢传导系统雏形在小鼠胚龄13d形成,呈TBX3阳性,Cx43阴性的互补性表达.致密心肌和中枢传导系心肌在15d仍为lamin A表达阴性,说明此部分心肌分化成熟较晚.
