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Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响
目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.
关键词： 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 肾小管上皮细胞 反义RNA 重组腺病毒 -
反义RNA在植物基因工程领域的应用进展
反义RNA广泛存在于各类生物中.它通过与靶RNA进行碱基互补配对的结合方式参与基因表达的调控.目前利用反义RNA技术调控植物基因的表达取得了很大进展,反义RNA在植物基因工程领域主要应用于抑制果实成熟、抗病、作为反向筛选标记基因、控制花色、控制淀粉合成、控制油料种子中脂肪酸的合成、控制雄性不育等方面.此外,通常采用反义RNA技术抑制食物中原有的与所需去除的化学成分合成有关的基因表达,降低或去除食物中的有害化学成分.反义RNA技术的研究尚处于初级阶段,但它作为一门新兴的生物技术必将在今后的农业发展中发挥重要作用.
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反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响
目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.
关键词： Dnmt1基因 反义RNA 乳腺癌 MDA-MB-435S -
DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立
目的建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株,用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系.方法运用基因工程的方法获得hMSH2 cDNA片段,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞(HLF),使之在HLF中表达,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平.结果构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体,并在真核细胞成功表达;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了44%.结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段.
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CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响
目的 应用反义RNA技术特异性下调结缔组织生长因子(CTGF)的表达,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响,并探讨其作用机制.方法 培养原代VSMC,使用脂质体法将携带有CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染入VSMC,Western Blot技术观察CTGF的表达以及蛋白激酶B(Akt)的活性,MTT法及划痕试验测定VSMC增殖和迁移情况.结果 pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC后CTGF的表达明显降低,Akt的活性降低,VSMC的增殖和迁移受到明显抑制.结论 应用反义RNA技术可特异性下调CTGF表达,并通过降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和迁移.
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反义RNA靶序列对大肠杆菌ftsZ基因沉默效果的影响
目的 筛选出能够有效引起大肠杆菌ftsZ基因沉默的反义RNA片段.方法 利用携带pairedtermini结构的质粒模仿天然asRNA的二级结构表达稳定的反义RNA,通过平板生长表象观察、菌体形态变化及液体培养生长速率变化考察了不同反义靶序列对大肠杆菌ftsZ基因沉默效果的影响.结果 ftsZ1、ftsZ4和ftsZ5 3个反义RNA片段可有效引起相关基因沉默.结论 获得的ftsZ1、ftsZ4和ftsZ5 3个反义RNA片段可进一步用于ftsZ特异性酶抑制剂的超敏全细胞模型构建.
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GPR40反义RNA对胰岛β细胞内Ca2+浓度及胰岛素分泌的影响
目的 应用反义RNA技术特异性下调胰岛β细胞G蛋白耦联受体(GPR40)的表达,观察其对胰岛β细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)及胰岛素分泌的影响.方法 体外分离SD大鼠胰岛β细胞,将GPR40反义RNA表达载体pcDNA3.1(+)-GPR40(-)用脂质体体外瞬时转染胰岛细胞,Western blot检测GPR40蛋白的表达,将1.0 mmol/L游离脂肪酸(软脂酸∶油酸=2∶1)与胰岛细胞共培养10,30,60 min,进行高葡萄糖刺激胰岛素释放试验,利用荧光探针Fura-2/AM,测定胰岛细胞[Ca2+]i变化,放射免疫法检测培养液中胰岛素浓度变化.结果 与对照组和空白质粒转染组比较,GPR40反义RNA可显著降低细胞GPR40蛋白的表达水平(P＜0.05),在各作用时间点,GPR40反义RNA转染组[Ca2+]i显著低于对照组(P＜0.05),同时GPR40反义RNA转染组胰岛细胞的胰岛素分泌明显低于对照组(P＜0.05).结论 GPR40介导游离脂肪酸刺激β细胞内[Ca2+]i升高和胰岛素分泌.
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从反义RNA到RNA干扰:科学突破的机遇与创新
RNA干扰是近年发现的存在于真核细胞内的一种重要防御机制,现已发展成为一种全新的基因阻断技术,广泛用于抗病毒、抗肿瘤和后基因组时代基因功能研究.它是在反义RNA研究中意外获得的重大科学突破,其发现过程对科学研究有重要启示意义.
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两种抑制MHCⅡ类分子表达方法的比较
目的:评价CⅡTA(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性,为改造MHC分子奠定基础.方法:用PCR、酶切及连接技术,构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2,含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3突变体及CⅡTA基因的反义RNA-pcDNA3/CⅡTA反.用脂质体转染法,将突变体、反义RNA及空载体pcDNA3转入PIEC细胞和L23细胞中.持续四个月,流式细胞术观察它们对PIEC/L23细胞株MHCⅡ类(SLA-DR)分子的诱导性和组成性表达的影响.结果:转染pcDNA3、pcDNA3mCⅡTA2后,PIEC/L23细胞SLA-DR的表达没有受到抑制,转染pcDNA3mCⅡTA3后,9/20(45.0%)的PIEC细胞、10/20(50.0%)的L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达90%以上;转染pcDNA3mCⅡTA反后,7/15(46.7%)PIEC细胞、5/15(33.3%)L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达85%以上.持续检测4个月,转染pcDNA3mCⅡTA3的PIEC/L23细胞SLA-DR的表达受抑率均在90%以上.转染反义RNA的PIEC/L23细胞在第65/45天,SLA-DR表达抑制率降至10%以下.结论:构建成功的CⅡTA突变体和反义RNA均能有效抑制SLA-DR表达,但CⅡTA突变体稳定存在于胞内的时间长,构建突变体是利用CⅡTA抑制MHCⅡ类分子的好方法.
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survivin反义寡核苷酸在体外诱导胰癌细胞凋亡
目的:探讨survivin反义核酸对胰腺癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响.方法:用脂质体瞬时转染法介导survivin反义核苷酸处理胰腺癌Panc-1细胞后,MTT试验测定转染细胞的相对存活率,RT-PCR检测survivin mRNA表达,琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞的凋亡诱导作用.结果:转染survivin反义核酸的Panc-1细胞增殖明显受抑制,与对照进行比较,具有显著性差异(P＜0.05);经琼脂糖凝胶电泳,转染survivin反义核酸的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带,而对照细胞未见到.结论:survivin反义核酸能够诱导Panc-1细胞凋亡.
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MHC基因反义RNA导入造血干/祖细胞的研究
目的:将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(×)Bam HI位点中,构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体,用脂质体法导入PA317细胞.方法:用免疫磁珠法分离,富集CD34+脐血造血干/祖细胞.含编码人HLA-DRB1基因的pcDV1质粒,用Bam HI酶解,回收HLA-DRB1 cDNA片段,将cDNA片段反向插入pZIP-neoSV(×)逆转录病毒载体,经扩增、抽提、酶切鉴定,用脂质体将反义RNA重组体导入到PA317细胞,用含G418 300 μg/ml培养液筛选,获抗性克隆,流式细胞仪检测HLA-DR抗原阳性细胞数.结果:重组质粒转染PA317细胞后,其病毒滴度达1×105CFU/ml,脐血造血干/祖细胞经免疫磁珠富集后,CD34+细胞高达85.0%～90.0%,导入反义RNA的脐血干细胞,其HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降至28.0%,抑制率达38.2%,而导入空载体后从56.0%降至45.0%,差异不显著.结论:HLA-DR的反义RNA能导入脐血干细胞,降低HLA-DR抗原的表达.
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逆转录病毒载体介导双靶区乙型肝炎病毒反义RNA模型的构建
构建在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒(HBV)双靶区反义核酸重组载体用以抗HBV基因治疗的研究.方法为合成互补于HBV(ayw亚型)X区核苷酸X片段以及互补于HBV P区的P片段,利用基因重组技术将X、P片段分别正向、反向插入逆转录病毒载体pLXSN的相应酶切位点构建成单靶区重组载体质粒.在构建单靶区载体质粒的基础上,类似方法再构建双靶区重组载体质粒.经酶切电泳、PCR扩增和DNA测序鉴定成功构建了HBV双靶区反义核酸重组载体.为探索在真核细胞内转录表达HBV反义RNA的方法及研究多基因区抗病毒治疗和抗变异病毒打下基础.
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CKS1 siRNA对人舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的抑制作用
目的：探讨 CKS1 siRNA 对人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞中 CKS1蛋白的干扰作用。方法设计特异性 CKS1插入序列，转入Tca8113细胞，应用免疫组化、RT－PCR、Western印迹检测Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达。结果 CKS1 siRNA成功导入并抑制了 Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达（P＜0．05）。结论 CKS1 siRNA能抑制Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达，应用CKS1 siRNA治疗舌癌具有可行性。
关键词： CKS1 siRNA Tca8113细胞 免疫组化 反义RNA CKS1蛋白 -
反义RNA技术的应用与进展
反义RNA技术作为反义核酸技术之一,已在越来越广泛的领域得到应用.本文在与反义寡核苷酸技术进行比较的基础上,系统地介绍了反义RNA技术方法及在各领域的应用.相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入,反义RNA技术必将成为一种有力的工具,在基因功能研究方面,特别是在后基因组研究中做出巨大贡献.
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反义RNA的作用机理及其在植物基因工程领域的应用
本文综述了反义RNA在原核生物和真核生物中的作用机理,并系统地介绍了反义RNA技术在植物基因过程中的研究进展.
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反义RNA抑制乙肝病毒复制的临床分子生物学研究
目的研究表达反义RNA的逆转录病毒载体体外转基因抗乙肝病毒(HBV)的作用，为临床治疗乙型肝炎探索一条新途径。方法合成互补于HBV X区(1400-1430)的X片段，互补于HBV P区(2375-2405)的P片段，分别构建表达正、反义X或P的重组逆转录病毒载体质粒PLXSN+Xpos/Ppos，PLXSN+X，PLXSN+P，转染PA317细胞，用假病毒颗粒感染2.2.15细胞后第8天，提取细胞内DNA和RNA，用荧光PCR(FQ-PCR)定量方法检测2.2.15细胞的DNA和RNA。结果反义RNA对HBV S、C、P三个开放读码区的DNA及RNA抑制作用大。结论细胞内表达HBV反义RNA是有明显抗乙肝病毒复制和表达的作用，为将来临床应用多基因区抗乙肝病毒治疗及抗变异病治疗打下基础。
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 反义RNA 基因治疗 -
用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP2/O生长的比较研究
目的本研究旨在比较靶向bcl-2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2/O细胞生长的抑制作用.方法采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl-2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2/O细胞生长、bcl-2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用.结果检测结果证实bcl-2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl-2正义RNA对上述指标无显著增强作用.提示LdsRNA对bcl-2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗.
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RAB5A基因对大肠癌细胞侵袭能力的影响
目的研究RAB5A基因转染后对大肠癌细胞侵袭能力的影响.方法用脂质体将RAB5A反义寡核苷酸转染人大肠癌细胞LS174T,48h后transwell小室法观察其对细胞转移能力的影响.结果 RAB5A反义寡核苷酸转染后48h,transwell小室结果可见转染后大肠癌细胞LS174T的侵袭和运动能力明显低于对照组(P《0.01).结论 RAB5A在人大肠癌细胞的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程,在细胞内发挥预期作用.
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应用重组基底膜侵袭技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究
目的研究RAB5A基因转染后对肺腺癌侵袭能力的影响.方法采用重组基底膜侵袭实验,观察转染前后的细胞系对基底膜侵袭能力的改变.结果转染pcDNA3.1-RAB5A正义表达载体的AGZY83-a细胞系基底膜侵袭能力增强,转染pcDNA3-AntiRAB5A反义RNA重组质粒的Anip973细胞系侵袭能力明显减弱.结论 RAB5A在人非小细胞肺癌的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程,在细胞内发挥预期作用.
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基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究
目的:研究RAB5A基因转染后对肺腺癌侵袭能力的影响.方法:采用重基底膜侵袭实验,观察转染前后的细胞系对基底膜侵袭能力的改变.结果:转染PcDNA3.1-RAB5A正义表达载体的AGZY83-a细胞系基底膜侵袭能力增强,转染PcDNA3-AntiRAB5A反义RNA组质粒的Anip973细胞系侵袭能力明显减弱.结论:RAB5A在人非小细胞肺癌的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程,在细胞内发挥预期作用.
